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目的:(1)脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后,在原发损伤的基础上会出现严重的继发性损伤,造成二次伤害,带来严重的并发症。二次损伤的机制十分复杂,既往研究发现脊髓损伤后使损伤局部出现微循环血管网的破坏,目前对于脊髓损伤后血管破坏有一定的研究,但对于血管网破损及其血管新生和修复的机制还不是十分明确。本研究目的之一即观察脊髓损伤后血管网的变化情况,并且基于Notch通路、VEGF、Ang-1/Tie-2等血管新生因子探讨血管新生的相关机制;同时观察损伤后神经细胞的变化情况,为通过促进血管新生治疗SCI提供相关的理论基础。(2)研究Notch-1蛋白和EGFL-8蛋白对HUVEC血管内皮细胞和Schwann神经细胞增殖、划痕和迁移等的影响,探讨它们对血管新生和神经保护的作用。(3)在中医辩证理论指导下,急性脊髓损伤属于肾虚血瘀证,治当补肾活血。本实验拟通过运用补肾活血方(BSHXF)进行相关研究,体外实验中观察BSHXF对血管内皮细胞(HUVEC)成血管的作用;体内实验中观察其对SD大鼠脊髓损伤后损伤组织区域血管网修复的影响和相关机制,及其对SCI后神经细胞的影响。方法:(1)脊髓损伤后微循环血管网的变化及相关机制研究。将正常SD大鼠分为假手术组(Sham组)和模型组(SCI组),观察SCI后不同时间点BBB行为学评分,HE染色观察损伤区域的病理情况;免疫荧光染色观察相关血管二维情况;microfil血管灌注造影后行micro-CT扫描,观察血管的三维结构情况;Western blot实验检测Notch-1、VEGF、Ang-1/Tie-2和EGFL-8相关蛋白的变化情况;免疫荧光实验观察损伤区域GFAP和MAP-2蛋白的表达情况。(2)运用细胞增殖、划痕、tube formation和Western blot相关实验观察Notch-1蛋白和EGFL-8蛋白对血管内皮细胞(HUVEC)的增殖、划痕愈合、迁移及血管形成功能的影响,以及它们对Schwann细胞的增殖、划痕和在transwell小室中迁移的影响。(3)BSHXF对大鼠脊髓损伤模型的治疗作用、血管新生和相关机制的研究。体外实验观察BSHXF对HUVEC细胞的增殖、划痕、迁移及血管形成的影响,及其对鸡胚血管新生的作用。体内实验中观察BSHXF对SCI大鼠BBB行为学评分的影响,检测BSHXF对损伤局部血管网的修复情况,Western blot和PCR实验检测BSHXF对损伤脊髓中Notch通路、Ang-1/Tie-2和EGFL-8等相关通路的影响;检测BSHXF对SCI动物模型氧化应激反应、星形胶质细胞和神经元细胞的影响。结果:(1)BBB行为学评分提示脊髓损伤造模后会即刻出现双下肢完全瘫痪,在损伤后第1周和第2周会有一定程度的康复,BBB评分恢复程度较多;第3周和第4周进入较为缓慢的康复期,其BBB评分改善程度较小。microfil血管造影和CD31免疫荧光实验结果提示脊髓损伤后出现血管密度下降;尽管在损伤后会有一定的自我修复,但仍然有一定的局限性,到第28天时仍然存在血管网的缺损。WB实验探讨相关机制研究结果提示,在急性脊髓损伤动物模型中,Notch-1首先会出现应激性上调,在损伤第3天时其表达量达到高峰,在第7天时虽然较第3天有所下降,但仍然比正常组要明显上调;到第14天时,其表达量出现下降;到第28天时,会进一步地出现下降,明显低于正常组的表达量。相应地,N otch下游通路Jag-1,Hes-1,以及VEGF和Ang-1/Tie-2的表达量也出现与Notch-1大致类似的先升后降的表达趋势,说明Notch-1调控VEGF和Ang-1/Tie-2等相关血管新生因子参与脊髓损伤后的血管新生。同时,EGFL-8蛋白在脊髓损伤后,在损伤第7天时,出现升高的趋势,达到高峰;在第14天开始逐渐下降,但仍然较正常组的表达量要高;到第28天时持续下降,提示EGFL-8可能具有一定的促血管新生的作用,但其参与血管新生的时间点与Notch不一致。伴随着脊髓损伤后血管网的破坏,损伤区域神经元细胞数量出现减少,星形胶质细胞出现活化,尤其是后期由于过度活化形成的胶质瘢痕可能对血管新生和神经功能修复造成一定的影响。(2)体外实验结果提示,Notch-1蛋白在200ng/ml浓度时能够促进HUVEC细胞的增殖、划痕愈合、迁移以及血管形成的能力,对Schwann细胞的增殖、划痕愈合和迁移有促进作用,其抑制剂DAPT会减弱其效果。EGFL-8与Notch-1蛋白具有类似的效果,在100ng/ml时,可促进血管内皮细胞的增殖、划痕和血管的形成,同时,也能促进Schwann细胞的增殖和迁移,具有潜在的神经保护的作用。(3)在BSHXF的相关实验中,当浓度为7.5mg/ml时,可以促进HUVEC的增殖、细胞划痕愈合、迁移和血管形成,同时对鸡胚血管新生具有一定的促进作用。在动物实验中,SCI大鼠进行BSHXF干预后,与模型组相比,BSHXF治疗组中BBB评分得到明显的改善。microfil血管造影及荧光染色提示BSHXF对局部血管网的修复具有一定的改善作用。Western blot和PCR实验结果表明,经过BSHXF的干预治疗,Notch-1、Ang-1/Tie-2和EGFL-8的蛋白表达量出现升高,提示BSHXF通过Notch-1调控血管新生参与急性脊髓损伤后血管网的修复。伴随着损伤区域血管的修复,脊髓损伤组织中SOD、MDA活力情况得到平衡,Nox-1和H0-1等氧化应激相关蛋白的表达量得到改善;GFAP蛋白的表达量出现降低,星形胶质细胞的活化水平减小,同时,MAP-2的表达量升高,说明神经元细胞得到一定的保护,因而促进了脊髓损伤后神经功能的修复。结论:(1)Notch-1调控VEGF、Ang-1/Tie-2和EGFL-8参与脊髓损伤后血管新生的机制中。(2)Notch-1蛋白和EGFL-8蛋白可促进HUVEC细胞增殖、划痕愈合、迁移和血管形成,具有一定的促血管新生的作用;对Schwann细胞的增殖、划痕愈合和迁移具有促进作用,具有潜在的神经保护作用。(3)体外实验中,补肾活血方具有促进血管新生的作用;体内实验中,补肾活血方可以通过Notch-1调控VEGF、Ang-1/Tie-2和EGFL-8促进脊髓损伤后的血管新生,可改善局部氧化应激反应和抑制星形胶质细胞的过度活化,对神经元细胞具有一定的保护,从而起到改善SCI后神经功能的作用。