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本研究根据Genbank中CTX-M-1组超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因序列为目的基因,设计并合成了特异性引物,采用PCR技术,以产CTX-M型ESBLs菌株的质粒为模板,扩增出CTX-M型ESBLs全基因,将全基因序列克隆到PGM-T载体上并测序,测序结果表明其开放阅读框有876个碱基,编码291个氨基酸。将序列结果送交国际β-内酰胺酶认证机构(http://www.lahey.org/Studies),证实本研究扩增的序列是一种新型的CTX-M型ESBLs基因,命名为CTX-M-69(GenBank登录号:EU402393),蛋白质序列编号为ABY91281.1。将CTX-M-69核苷酸序列及推导氨基酸序列与国内外其它CTX-M型ESBLs进行同源性比较,结果显示,CTX-M-69序列与CTX-M-1(GenBank登录号:X92506)的核苷酸同源性为98%(867/877),与CTX-M-1编码的氨基酸序列(GenBank登录号:CAA63262.1)同源性为98%(287/291),确定CTX-M-69基因属于CTX-M-1组。与CTX-M-1相比,有10个核苷酸位点发生突变,其中6个位点为无义突变,4个位点发生了氨基酸替换。同时,与GenBank上同一组的部分CTX-M型氨基酸序列比较发现,同源性达到了98.9%以上。采用PCR技术,以CTX-M-69基因克隆载体为模板,扩增出蛋白的编码基因(876bp),并将其插入pET-30b(+)表达质粒,构建了ESBLs CTX-M-69重组表达质粒。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE结果表明表达出33kD左右的融合蛋白,可溶性检测表明表达产物以可溶性形式(上清中)和包涵体形式(沉淀中)两种形式存在。通过对表达条件的优化,试验确定ESBLsCTX-M-69蛋白表达的最佳条件为诱导物IPTG 0.4mmol/L,30℃诱导培养4h,在最佳表达条件下,重组蛋白表达含量有较明显的提高。CTX-M-69基因工程菌对头孢噻肟、头孢他啶、含克拉维酸的头孢噻肟和头胞他啶的药物敏感性试验,结果表明基因工程菌符合产超广谱β-内酰胺酶的表型特征(NCLLs2006),表明CTX-M-69基因工程菌产ESBLs。同时,重组蛋白对12种β-内酰胺类水解活性的测定表明抗菌谱与CTX-M-1组大致相当,最大的区别在于CTX-M-69型ESBLs对头孢他啶的水解能力较弱。试验测定结果表明CTX-M-69型ESBLs在pH为7.8～8.6,温度为30℃时活性最大,底物浓度过大时酶的活性反而受到抑制。本实验利用PCR技术克隆出CTX-M型ESBLs全基因,首次发现了ESBLs新基因CTX-M-69,构建了ESBLs CTX-M-69基因的原核表达系统,实现了ESBLsCTX-M-69的高效表达,初步测定酶动力学特征,为进一步研究ESBLs CTX-M-69基因的结构、生物学活性及其蛋白质的空间构象提供了理论基础。