研究背景：甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)外观似冰,俗称“冰毒”,是一种无色、无臭的纯白结晶或粉末,属于苯丙胺类中枢神经兴奋剂。甲基苯丙胺目前已成为全球第二位广泛使用的非法药物,因其起效快、兴奋时间持久、合成原料容易获取、合成技术简单、可经多种途径摄取等特点,METH的滥用在世界范围内快速蔓延。在我国,METH的滥用呈现出区域逐渐扩大、滥用率急剧增长、年龄结构低龄化等特点,不仅造成滥用者机体及精神损害,而且引发了大量刑事案件,严重危害公共安全。METH不仅会造成机体成瘾性,对神经元也造成严重损伤,在法医工作中,也遇到不少因METH引起的猝死案例。因此,METH引起的毒性损伤研究已经成为世界性的研究热点,也取得了一定的成绩。METH所致的神经毒性损伤机制仍不完全清楚,但绝大多数研究表明,METH主要对动物及人类大脑多巴胺能神经元具有毒性作用,主要涉及以下机制：包括高热、氧化应激损伤、谷氨酸兴奋性毒性作用、线粒体功能紊乱、神经细胞凋亡、神经胶质细胞活化及细胞因子产生、神经元退行性变等。其中,氧化应激与其他机制密不可分,而线粒体在氧化应激中起着重要作用。本教研室构建了PC12细胞的甲基苯丙胺给药模型进行基因芯片筛查,发现与线粒体凋亡有关的Bcl-2(B-cell lymphoma 2)家族基因之一p53上调凋亡调制物(53upregulated modulator of apoptosis,PUMA)比正常对照组细胞明显升高。PUMA属于Bcl-2家族中的BH3-only(即仅含BH3结构域的家族)的重要成员之一。Bcl-2家族分为抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白及BH3-only三个家族,是线粒体凋亡途径的开关。PUMA因具有强大的促凋亡功能,其诱导凋亡机制的研究是近几年线粒体凋亡通路研究的热点,而这与PUMA的BH3结构域的功能息息相关。PUMA可以通过与线粒体膜上的Bcl-2抗凋亡蛋白结合,从而解除Bcl-2对直接促凋亡蛋白,如BID、BIM、p53等的作用,间接诱导细胞凋亡。PUMA还可以通过与线粒体膜上的促凋亡蛋白Bax结合,直接激活Bax,直接促进细胞凋亡。但是,这些研究大部分集中在肿瘤的凋亡机制及防治方面,而PUMA与METH引起的神经毒性方面的研究未见报导。本课题拟建立METH中毒PC12细胞及SH-SY5Y细胞模型,通过形态学观察、检测PUMA蛋白表达变化进一步验证基因芯片的结果。再通过设计特异的小干扰RNA片段对PUMA蛋白表达进行阻断,进而使用流式细胞技术,TUNEL染色及检测凋亡Maker基因,包括Caspase-3和PARP表达情况探讨细胞凋亡与PMUA的关系。为了进一步探讨METH是否介导PUMA通过线粒体途径导致凋亡,检测了Bcl-2和Bax表达变化情况及细胞胞浆及线粒体内细胞色素c (cytochrome c, Cyt c)的位置转移情况。本课题拟证明PUMA在METH介导的细胞凋亡中的作用,为METH神经毒性损伤机制研究及基因干预治疗提供理论依据。目的：建立METH中毒PC12细胞及SH-SY5Y细胞模型,通过形态学观察、PUMA蛋白表达变化进一步验证基因芯片的结果。再通过设计特异的PUMA小干扰RNA片段对PUMA蛋白表达进行阻断,进而使用流式细胞技术,TUNEL染色及检测凋亡Maker基因,包括Caspase-3和PARP表达情况探讨细胞凋亡与PMUA的关系。进一步检测Bcl-2和Bax表达变化情况及细胞胞浆及线粒体内Cyt c的位置转移情况,探讨METH是否介导PUMA通过线粒体途径导致凋亡,从而证明PUMA在METH介导的细胞凋亡中的作用,为METH神经毒性损伤机制研究及基因干预治疗提供理论依据。方法：1. METH中毒PC12细胞及SH-SY5Y细胞模型建立(1)10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基分别接种PC12细胞及SH-SY5Y细胞于96孔板中,37℃和5%CO2条件下培养,待细胞密度达到70%时,分别使用0mmol/L、0.5mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、 3mmol/L、3.5 mmol/L、4mmol/L、4.5mmol/L、5 mmol/L METH的2%FBS的DMEM培养基培养24小时后,CCK-8法测定不同浓度的METH处理后PC12细胞和SH-SY5Y细胞的LC25, LC50。(2)分别将PC12细胞及SH-SY5Y细胞接种于六孔板中,待细胞密度达到70%时,PC12细胞用浓度为Ommol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0 mmol/L和4.0 mmol/L, SH-SY5Y细胞用浓度为0mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L和2.5 mmol/L METH的2% FBS的DMEM培养基培养24小时,然后提取细胞总蛋白,Western Blot检测细胞PUMA蛋白的表达变化情况,以此选取合适浓度建立细胞中毒模型。(3)在上述实验的基础上,选择一个合适的METH浓度建立细胞中毒模型,以该浓度METH溶液分别处理0小时、2小时、4小时、8小时、16小时、24小时,24小时后提取细胞总蛋白,Western Blot检测细胞PUMA蛋白的表达变化情况,以此选择合适的METH作用时间。2. PUMA在METH诱导的神经细胞凋亡中的作用(1)分别设计针对PC12细胞及SH-SY5Y细胞的PUMA siRNA干扰片段,使用lipo2000脂质体转染的方法处理细胞,Western Blot检测细胞PUMA蛋白的表达情况,以此选出有效的干扰片段。(2)将PC12细胞及SH-SY5Y细胞分为空白对照组(Ctrl)、对照+小干扰组(siRNA)、给药组(METH)、给药+小干扰组(METH+siRNA),处理24小时后,收集细胞蛋白检测PUMA、Caspase3、PARP表达情况。(3)流式细胞术及TUNEL染色法检测各组细胞凋亡情况。3. PUMA通过线粒体途径介导METH诱导的神经细胞凋亡(1)检测上述各组细胞Bcl-2和Bax表达情况,并计算比较Bax/Bcl-2比值。(2)分别提取上述各组细胞胞浆及线粒体内蛋白,检测细胞胞浆及线粒体内Cyt c表达变化情况。结果：1. METH中毒PC12细胞及SH-SY5Y细胞模型建立(1)随着METH浓度升高,PC12细胞及SH-SY5Y细胞的存活率逐渐降低,其中PC12细胞的LC25和LC50分别为3.42 mmol/L和4.53mmol/L, SH-SY5Y细胞的LC25和LC50分别为2.14 mmol/L和3.42mmol/L。。(2)分别以Ommol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、2.5 mmol/L、3.0 mmol/L和4.0 mmol/L METH溶液处理PC12细胞,Western Blot结果显示PUMA随着METH浓度的升高,其表达量也逐渐升高,其中PUMA的表达量在3.0 mmol/L时与Ommol/L的空白对照组相比升高约4.5倍。(3)分别以0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L和2.5 mmol/L METH溶液处理SH-SY5Y细胞,Western Blot结果显示PUMA随着METH浓度的升高,其表达量也逐渐升高,其中PUMA的表达量在2.0 mmol/L时与Ommol/L的空白对照组相比升高约2倍。(4)用3.Ommol/L METH溶液分别处理PC12细胞0小时、2小时、4小时、8小时、16小时、24小时,Western Blot结果显示PUMA随着METH处理时间的延长,其表达量也逐渐升高,其中PUMA的表达量在2小时开始升高,在16小时达到峰值。而用2.0mmol/LMETH溶液分别处理SH-SY5Y细胞0小时、2小时、4小时、8小时、16小时、24小时,Western Blot结果显示与PC12细胞类似结果,PUMA随着METH处理时间的延长,其表达量也逐渐升高,其中PUMA的表达量在2小时开始升高,在8-24小时达到约为空白对照组的2倍。2. PUMA在METH诱导的神经细胞凋亡中的作用(1)使用特异性siRNA干扰片段后,各组细胞经过不同处理24小时后,倒置显微镜下观察细胞形态,可以看到与空白对照组(Ctrl)相比,对照+小干扰组(siRNA)的细胞形态没有发生明显变化；而无论是PC12细胞还是SH-SY5Y细胞,给药组(METH)细胞形态学发生明显改变,其中细胞的突触缩短,细胞胞体变圆,圆形胞体四周可见环形透亮区,细胞间连结疏松,部分细胞脱壁,漂浮于细胞液中;而给药+小干扰组(METH+siRNA)细胞形态有所改善。(2)使用特异性siRNA干扰片段后发现,相对于单独使用METH组来说,PUMA蛋白表达下降。其中,针对PC12细胞的METH+siRNA#1和METH+siRNA#2组,PUMA的表达量较METH组约下降60%；而针对SH-SY5Y细胞的siRNA#3和siRNA#4,其中METH+siRNA#3与METH组比较,PUMA的表达量约下降40%,而siRNA#4干扰片段无效。(3)流式细胞术检测PC12细胞及SH-SY5Y细胞各组的细胞凋亡情况,结果发现,siRNA组与Ctrl组相比没有显著差异,而METH组中细胞的凋亡明显增加,其中PC12细胞的总凋亡率为17.5±0.13%,SH-SY5Y细胞的总凋亡率为22.9±4.56%; METH+siRNA与METH组相比,两组细胞均有明显降低。(4) TUNEL法检测PC12细胞及SH-SY5Y细胞各组的细胞凋亡情况,结果发现,siRNA组与Ctrl组相比没有显著差异,而METH组中细胞凋亡阳性数明显增加,其中PC12细胞总凋亡阳性数约增加6倍,SH-SY5Y细胞总凋亡阳性数约增加7倍；METH+siRNA与METH组相比,两组细胞均有明显降低。3. PUMA通过线粒体途径介导METH诱导的神经细胞凋亡(1)使用特异性siRNA干扰片段后,各组细胞经过不同处理24小时后,Western Blot方法检测Bcl-2和Bax蛋白发现,在PC12细胞中,与Ctrl组相比,METH组Bcl-2表达降低,而Bax表达升高,Bax/Bcl-2比值升高；而METH+siRNA与METH组相比发现这种效应被逆转,Bcl-2表达升高,而Bax表达降低,Bax/Bcl-2比值降低。在SH-SY5Y细胞中也出现类似结果。(2)使用特异性siRNA干扰片段后,各组细胞经过不同处理24小时,分别提取胞浆蛋白及线粒体蛋白,Western Blot方法检测Cyt c蛋白发现,在两种细胞中,与Ctrl组相比,METH组线粒体内的Cyt c表达减少,而胞浆中Cyt c表达增多;而METH+siRNA与METH组相比,线粒体内的Cyt c表达增多,而胞浆中Cyt c表达减少。(3)使用特异性siRNA干扰片段后,各组细胞经过不同处理24小时后,Western Blot方法检测Caspase3和PARP蛋白发现,两种细胞中,与Ctrl组相比,METH组Caspase3和PARP蛋白表达增加；而METH+siRNA与METH组相比,Caspase3和PARP蛋白表达降低。结论：1.METH处理引起PC12细胞及SH-SY5Y细胞存活率降低,PUMA基因表达升高。2.METH处理后,PC12细胞及SH-SY5Y细胞凋亡均升高,敲低PUMA表达后,凋亡降低。3.METH处理后,Bax表达升高,Bcl-2表达降低；敲低PUMA后,Bax表达降低,而Bcl-2表达升高。4. METH处理后,Cyt c从线粒体内流出胞浆增多；敲低PUMA后,阻止了Cyt c从线粒体内流出胞浆增多。5. METH处理后,Caspase3、PARP表达增加,敲低PUMA后,Caspase3、 PARP表达下降。