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植物对病原的识别,主要通过细胞膜表面的分子模式识别受体(pattern-recognition receptors, PRRs),识别微生物相关的分子模式(microbe-associated molecular patterns, MAMPs),或者通过细胞内核结合的重复富亮氨酸(nucleotide-binding leucine-rich repeat, NB-LRR)作为效应蛋白识别病原。这一过程通过交叉或特异的信号路径参与蛋白激酶激活、Ca2+信号路径、激素生物合成、氧化爆发和转录重组。其中,Ca2+能够被钙依赖性蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPKs或CPKs)识别,并作为二级信使起重要作用。小麦作为人类重要的粮食作物,其生长和产量受生物胁迫和非生物胁迫的严重影响。CPKs作为重要的Ca2+信号感应器,参与复杂的免疫和胁迫信号路径,但小麦中关于钙依赖性蛋白激酶基因功能的报道还很有限。在前期研究中,我们发现TaCPK2响应白粉菌诱导(PM; Blumeria graminis tritici, Bgt)。本论文在此基础上,对TaCPK2的三个部分同源基因TaCPK2-A/B/D分别进行鉴定,并进一步对TaCPK2-A的功能及其参与抗病性的分子机制进行研究。利用已报道的TaCPK2序列(AY704444)设计的引物,从中国春(Chinese Spring, CS)中获得三种类型的cDNA序列,根据其与二倍序列的相似性,将其分别命名为TaCPK2-A、TaCPK2-B、TaCPK2-D。这三个同源基因分别包含1677bp、1680bp、1671bp的编码序列,并分别编码558、559、556个氨基酸。这三个蛋白的一致性为96.9%-98.1%。与其水稻正源基因OsCPK13蛋白序列的比对分析,发现TaCPK2蛋白,含有特异的N端可变区、保守的激酶区(LGQGQFGT、K和D)和EF手结构区(DDSE或者DDDE),说明三个同源基因都编码功能蛋白。根据N端可变区SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)设计的基因特异引物,利用CS缺四体(nulli-tetrasomic, NT)对TaCPK2-A、TaCPK2-B、TaCPK2-D进行染色体定位,发现TaCPK2-A、TaCPK2-B、TaCPK2-D分别特异定位于2A、2B、2D染色体上。利用最近发表的A基因组供体种(T. urartu)和D基因组供体种(Ae. tauschii)的基因组序列,从中国春中分别获得TaCPK2-A和TaCPK2-D基因起始密码子ATG前1.5kb的启动子序列。利用启动子顺式调控元件预测网站http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html),对TaCPK2-A和TaCPK2-D的启动子进行分析,发现TaCPK2-A的启动子包含两个抗病顺式调控元件WBOXATNPR1(WBO),而TaCPK2-D的启动子包含两个抗冷顺式调控元件LTRECOREATCOR15(LTR)。利用基因特异引物对其应答情况进行检测,发现TaCPK2-A特异应答Bgt诱导,而TaCPK2-D特异应答冷胁迫诱导,对Bgt诱导的应答较弱,说明这两个基因启动子的分化可能导致其亚功能化。通过病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)方法,在一个抗真菌病害白粉病的小麦品系中沉默TaCPK2-A后,导致抗病品系PmA(PmAm6/Beijing837BC5F3)感病,说明TaCPK2-A在小麦抗病中起重要作用。qRT-PCR结果显示TaCPK2-A在VIGS植株中特异下调。对叶片上白粉菌孢子的生长情况进行显微观察,发现BSMV:TaCPK2-A植株中的有次生菌丝生成,而对照BSMV:GFP植株中没有次生菌丝生成,说明TaCPK2-A VIGS植株对PM的敏感性增强。统计分析显示PM的穿透率(PE)在VIGS植株和对照中差异显著(19.01±6.13%比0%)。总之,在小麦中TaCPK2-A的高水平表达对PM抗性非常重要。通过过表达转化水稻的方法,在一个细菌病害白叶枯(Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo)感病株系空育131中,过表达TaCPK2-A后,增强水稻苗期和成株期对白叶枯的抗性。病斑长度统计,发现TaCPK2-A表达不断增强的转基因株系L1、L2、L3中,Xoo的病斑长度与对照相比分别降低到6.78%、5.06%和4.32%。为进一步验证TaCPK2-A的过表达没有影响水稻内源基因OsCPK13的表达,对其进行检测,发现在TaCPK2-A转基因植株中,OsCPK13的表达量没有受到影响。总之,TaCPK2-A转基因植株对Xoo抗病性的增强,确实是由TaCPK2-A的过表达引起的。为检测TaCPK2-A可能参与的抗病路径,对水稻中OsWRKY45-1及10个水杨酸(salicilic acid, SA)或者茉莉酸(Jasmonic acid, JA)路径基因的表达进行了检测。在空育131转基因植株中,与野生型相比,Xoo侵染后,过表达的TaCPK2-A能够上调WRKY45-1、LOX (lipoxygenase; D14000)、AOS2(alleneoxide synthase2; AY062258)、PRla (acidic pathogenesis related protein1; AJ278436)和PRlb (U89895)的表达(P<0.05)。对SA相关基因表达的影响不显著,如WRKY13、PAL (Phenylalanine ammonia lyase1; X16099)、ICS1(Isochorismate synthase1; AK120689)、PAD4(phytoalexin-deficient4; CX118864)、NH1(Arabidopsis NPR1homolog1; AY9123983)和PR10(ribonuclease; D38170).这些结果说明在水稻中TaCPK2-A可能通过影响WRKY45-1和JA信号路径相关基因增强抗病性。相比之下,在小麦BSMV:TaCPK2-A植株中,与对照BSMV:GFP相比,Bgt诱导后,OsCPK45-1的同源基因(Ta-05961)的表达显著下调(P<0.05)。相应地,LOX (Ta-2498165446)、AOS2(Ta-134687)及同两个PR基因PRla (Ta-01596)和PRlb (ta-141027)也明显下调,说明小麦中TaCPK2-A的作用机制与水稻中相似。在小麦中,过表达TaWRKY45的转基因植株能增强其对细菌和真菌病害的抗性,在本研究中,我们证明TaCPK2-A在小麦的真菌抗性和转基因水稻的细菌抗病性中可能通过调节TaWRKY45起作用。总之,TaCPK2-A在小麦PM(真菌)抗性和水稻白叶枯抗性(细菌)中介导保守的机制。总之,在小麦和水稻中,CPK2基因通过调节WRKY45-1和抗病基因相关的机制可能是广谱抗病性的保守机制,另外TaCPK2-A/D的亚功能化可能发生在六倍体形成之前。