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背景SDF-1/CXCR4(stromal cell-derived factor-1/CXC motif chemokine receptor type 4)轴与OA疾病的发生发展密切相关,越来越多的证据证实miRNA异常表达在OA的病理过程中扮演关键调控角色,因此探索参与调节SDF-1/CXCR4轴功能的miRNA对深入探究OA的发生发展具有重要意义。目的(1)明确OA患者膝关节软骨组织中miRNA的差异表达,并探索与SDF-1/CXCR4轴表达相关联且显著差异表达的miRNA;(2)探究与CXCR4存在靶向关系的miRNA,并研究该目标基因在关节软骨细胞凋亡及退变中的调控作用;(3)探究目标miRNA介导软骨凋亡及退变的下游信号通路。方法(1)OA患者膝关节软骨组织中miRNA差异表达分析:分别采集因创伤性手术截肢的成人膝关节软骨组织(n=9)及因严重OA行膝关节置换手术患者的膝关节软骨组织(n=9),于膝关节置换术及截肢术术中采集膝关节软骨组织,通过两步酶消法提取软骨细胞并进行原代细胞培养备用。随后在原代OA软骨细胞中加入SDF-1诱导原代软骨细胞24h,对软骨细胞行免疫组化染色,检测SDF-1诱导后原代软骨细胞中CXCR4的表达情况,分析两组样本中miRNA的差异表达,同时对结果进行靶基因预测,初步筛选出候选靶基因。(2)靶向CXCR4调控OA软骨细胞凋亡及退变;①SDF-1诱导正常人与OA患者原代软骨细胞24h,利用Q-PCR二次验证两组软骨细胞中通过基因芯片在软骨组织中所筛选出显著异常表达的候选靶基因。随后构建包含候选基因及目标基因抑制物的质粒,在原代OA患者软骨细胞中进行质粒转染。质粒转染完毕后,SDF-1诱导软骨细胞24h再通过Real-time PCR及Western blot检测CXCR4的基因及蛋白表达变化情况,进一步筛选目标靶基因;②构建野生型及突变型CXCR4 3’-UTR荧光素酶报告载体,检测目标靶基因对野生型及突变型CXCR4 3’-UTR荧光素酶活性的影响,明确目标靶基因与CXCR4是否存在靶向结合关系;③构建携带目标靶基因模拟物,目标靶基因抑制剂和CXCR4的质粒,以及未包含任何基因的空白质粒,分别转染入OA患者软骨细胞中作为实验组和对照组。软骨细胞转染48h后加入SDF-1诱导24h,通过流式细胞仪检测软骨细胞凋亡情况,同时行Western blot 检测凋亡相关因子蛋白(Bax,Bcl-2,cleaved caspase-3,cleaved PARP)表达情况;④转染质粒的软骨细胞中添加SDF-1诱导24h后取上清液,使用ELISA对培养基中IL-1β,IL-10与TNF-α的浓度进行检测,Real-time PCR,Western blot检测其中MMP-13的表达水平;⑤转染细胞添加SDF-1诱导24h后,对软骨细胞中Ⅱ型胶原(Collagen)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)进行免疫荧光标记,使用荧光酶标仪进行荧光强度检测,同时也分别检测以上各组软骨细胞中Collagen与Aggrecan的mRNA及蛋白表达水平。(3)目标miRNA介导软骨凋亡及退变的下游信号通路分析:构建携带靶基因模拟物,靶基因抑制剂和CXCR4的质粒,以及未包含任何基因的空白质粒,分别转染入OA患者软骨细胞中作为实验组和对照组。软骨细胞转染48h后加入SDF-1诱导24h,KEGG通路分析靶基因作用通路,寻找与目标miRNA关联最为密切的信号通路,利用Western blot检测其通路蛋白磷酸化水平的变化。结果(1)基因测序结果显示:相较于正常人组,OA患者膝关节软骨组织中共70个miRNA发生显著性差异性表达,其中共有53个miRNA表达发生显著下调,17个miRNA显著表达上调(变化倍数大于2,P<0.05)。通过靶基因预测显示:在差异表达变化倍数从高至低排名前15的基因中共4个基因(miR-150-5p,miR-142-5p,miR-513a-5p,miR-622)通过靶基因预测与CXCR4存在靶向关系,CXCR4在SDF-1诱导组软骨细胞中较空白对照组呈现高表达。(2)OA软骨细胞中PCR及Western验证候选靶基因结果与基因芯片在OA患者及正常成人软骨组织中的检测结果一致。其中miR-150-5p,miR-142-5p,miR-513a-5p,miR-622在高浓度SDF-1诱导后的软骨细胞中呈现出差异表达:miR-142-5p,miR-622 显著上调(P<0.05),miR-150-5p,miR-513a-5p 出现表达上调趋势,但无统计学意义(P>0.05)。miR-142-5p过表达对CXCR4表达有显著的抑制作用,双荧光素酶报告显示:突变型CXCR4 3’-UTR报告分子与miR-142-5p的相互作用不敏感,而野生型CXCR4 3’-UTR报告分子可与miR-142-5p较好结合,荧光强度明显减弱,该结果表明miR-142-5p与CXCR4互为靶基因。流式凋亡检测显示,miR-142-5p过表达组可同时显著降低软骨细胞凋亡率及凋亡相关蛋白(Bax,cleaved caspase-3及cleaved PARP)mRNA及蛋白表达水平,但与软骨细胞凋亡呈现负相关的Bcl-2表达则出现显著上调;ELISA检测结果显示:miR-142-5p过表达组中IL-1β,TNF-αα的表达水平下降,IL-10表达水平升高,同时MMP-13的表达量显著下降;miR-142-5p过表达组中软骨细胞中的Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚集聚糖含量显著升高,而CXCR4过表达组则相反,当miR-142-5p与CXCR4同时过表达时,miR-142-5p的过表达逆转了 CXCR4过表达对软骨细胞凋亡及软骨退变的负向调控作用。(3)OA软骨细胞中转染入携带miR-142-5p的质粒后,与对照组相比miR-142-5p可显著抑制SDF-1诱导后OA软骨细胞中MAPK通路的激活。当同时在OA软骨细胞中过表达CXCR4及miR-142-5p后,OA软骨细胞中CXCR4过表达所引起的MAPK通路激活,被miR-142-5p显著抑制。结论(1)OA患者较正常人膝关节软骨中的CXCR4表达量增加,同时miR-142-5p表达显著降低。(2)miR-142-5p与CXCR4互为靶基因,miR-142-5p可抑制CXCR4在软骨细胞中的表达,同时抑制在高浓度SDF-1诱导下软骨细胞凋亡,减少炎症相关因子分泌,降低软骨基质Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的降解。(3)miR142-5p通过MAPK通路抑制软骨细胞凋亡并延缓软骨退变的作用。