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新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-Ischemic Encephalopathy,HIE)是一种由围产期窒息引起的严重的损伤性中枢神经系统疾病。虽然近年来围产医学及新生儿疾病研究取得长足发展，但是HIE仍是导致新生儿死亡或永久性神经功能障碍的重要原因。目前，虽然亚低温疗法已被广泛应用于临床，并且促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)的应用也在足月和早产儿中表现出显著的神经保护作用，但是两种方法在临床应用上均存在局限性，在治疗上仅对部分患儿有效。因此迫切需要更加深入地探索和了解缺氧缺血（HI）后神经细胞死亡和脑损伤的机制，进一步针对如何减少细胞死亡，提高细胞存活率和促进未成熟脑的再生与修复，探索新的预防和治疗新生儿脑损伤的策略。
具有高耗氧率和低含量抗氧化因子特征的新生儿大脑极易遭受氧化应激损伤。在HI刺激下，新生儿大脑中发生的氧化应激、兴奋性毒性和炎症反应等可激活多种不同细胞死亡，包括细胞凋亡(apoptosis)、坏死(necrosis)、坏死性凋亡(necroptosis)、铁坏死(ferroptosis)和自噬(autophagy)等。与成人相比，新生儿大脑更容易受到细胞凋亡的影响。新生儿HI损伤后神经元细胞的损失与凋亡导致的神经元死亡密切相关。
细胞凋亡诱导因子(Apoptosis inducing factor,AIF)是caspase非依赖凋亡途径中的关键因子之一。AIF具有调控细胞存活和死亡的双重作用，生理状态下，AIF位于线粒体膜间隙，在氧化磷酸化和活性氧清除过程中发挥至关重要的作用；在促凋亡信号的诱导下，AIF从线粒体释放并转移至细胞核，诱导染色质固缩和DNA片段化。前期研究表明，在小鼠HI脑损伤模型中，AIF蛋白水平的降低表现出显著的神经保护作用；AIF是新生小鼠大脑HI损伤后神经元丢失的主要原因。研究虽然证明降低AIF表达量可以有效抑制AIF参与的细胞凋亡途径，减轻脑损伤程度，但是AIF缺乏可同时导致线粒体功能障碍和细胞能量代谢失衡，引发一系列代谢问题。目前，对于AIF下调所带来的神经保护作用的具体机制并不十分清楚，因此，在HI动物模型中，从体内水平进一步探讨AIF在HIE中发挥保护作用的内在机制具有十分重要的意义。
随着对AIF蛋白结构和功能研究的不断深入，发现Aif基因外显子2存在两种不同亚型(2a和2b)，AIF蛋白同样存在两种不同亚型，分别为普遍存在且表达量最多的亚型AIF1和脑特异性表达亚型AIF2。两者由于外显子2所编码的氨基酸序列的不同，在功能和理化特性上存在一定差异。相较于AIF1，AIF2蛋白中由外显子2b所编码形成的结构域具有更强的疏水性，表现出对蛋白水解酶的抗性。与AIF1相比，AIF2可以更加稳固地锚定于线粒体内膜(IMM)，所以在促凋亡信号的刺激下，AIF2比AIF1更难以从线粒体中释放并参与之后的凋亡途径。目前对于AIF1的研究最为普遍和深入，但对AIF2的探讨却并不多。因此，作为在脑组织中特异性表达和存在的AIF2，明确其在HI脑损伤中的作用将有助于我们更加深入理解AIF在HIE中的作用机制。
在促凋亡信号的刺激下，AIF从线粒体释放后需转移至细胞核中方能发挥其裂解染色质和使DNA片段化的作用。关于AIF具体的核转移机制仍不是十分清楚，研究表明AIF与亲环素A(CypA)相互作用并共同易位至细胞核。AIF诱导的神经元死亡需要AIF与CypA形成复合物后共同易位至细胞核。因此，以AIF/CypA复合物为靶点，通过抑制该复合物的形成和核转移或许将会是一种减轻HI后神经元损伤的策略。
本研究将分别采用AIF过表达和AIF2敲除转基因小鼠，通过构建新生小鼠HI脑损伤模型，从基因和蛋白水平探索AIF在HI诱导的脑损伤发生发展中的作用机制，同时探索抑制AIF核转移所表现出的脑保护作用，为HIE的预防和治疗提供新的措施。
第一部分 凋亡诱导因子过表达加重新生小鼠缺氧缺血性脑损伤
目的：
前期研究表明AIF下调可以显著降低HI诱导的脑损伤程度，但是因为AIF下调可同时导致线粒体功能障碍和细胞的能量代谢失衡，并引发一系列代谢问题，目前对于AIF下调脑保护作用的机制并不是十分清楚。本实验通过构建AIF过表达转基因小鼠而上调AIF表达量，研究AIF在新生小鼠HI脑损伤中的作用机制。
方法：
本实验基于LoxP-Cre系统构建AIF过表达转基因小鼠，使用出生后9天（P9）的AIF过表达小鼠制作HI脑损伤模型，随后分别在HI损伤后24小时和72小时收取小鼠脑组织样本，其中72小时样本用于脑损伤程度的评估，24小时样本则通过免疫组化、蛋白免疫印迹、ELISA和RT-qPCR等方法对潜在的分子机制进行探讨。
结果：
生理状态下，AIF过表达小鼠具有正常的表型，未发现表型的变化和生理功能的改变；在HI脑损伤病理状态下，AIF-Tg小鼠脑组织梗塞体积比WT小鼠增加74.6%，AIF过表达显著加重新生小鼠HI脑损伤；AIF过表达可导致HI后脑组织各区域AIF核转移的显著增多以及部分脑区caspase-3阳性细胞密度的升高；AIF过表达对线粒体相关蛋白的表达以及线粒体动力学没有显著影响。
结论：
1.AIF过表达对小鼠的表型及生理功能无明显影响。
2.AIF过表达可显著加重新生小鼠HI脑损伤程度，这与AIF从线粒体释放并转移至细胞核，以及特定脑区caspase-3的活化相关。
第二部分 凋亡诱导因子脑特异性亚型缺失加重新生小鼠缺氧缺血脑损伤
目的：
AIF2是一种脑组织特异性表达的亚型。与普遍存在的AIF1相比，AIF2蛋白中由外显子2b编码的氨基酸序列所形成的结构域具有更强的疏水性和蛋白酶抗性，因此，在损伤刺激后AIF2可以更稳固的锚定于线粒体IMM上而不会被轻易释放。本研究的目的是通过构建AIF2敲除小鼠并制备HI脑损伤模型，探讨AIF2在新生小鼠HI脑损伤模型中的功能特征。
方法：
本实验采用LoxP-Cre系统构建AIF2敲除(AIF2KO)转基因小鼠并使用P9AIF2KO小鼠制作HI脑损伤模型，分别在HI损伤后6小时、24小时和72小时留取小鼠脑组织样本，其中72小时样本用于脑损伤程度的评估，6小时和24小时样本则通过免疫组化、蛋白免疫印迹、ELISA和RT-qPCR等方法对潜在的分子机制进行研究。
结果：
AIF2KO小鼠在生理状态下未发现明显的表型异常；AIF2敲除对于脑组织中线粒体的呼吸功能没有显著影响；但是，AIF2敲除可显著增强HI后大脑的氧化应激反应，加重新生小鼠HI脑损伤；HI脑损伤后，AIF2KO小鼠脑组织中MDA的含量是WT小鼠的2.05倍，AIF2KO小鼠小鼠脑组织梗塞体积比WT小鼠增加37.6%；对细胞死亡途径的研究结果显示，AIF2敲除对caspase依赖和caspase非依赖细胞死亡途径没有显著影响。
结论：
1.AIF2敲除小鼠的表型未见异常。
2.AIF2敲除可引起AIF1表达的代偿性增加，并且AIF1/AIF2比值的变化可增强氧化应激反应和加重新生小鼠HI脑损伤程度。
第三部分 抑制凋亡诱导因子与亲环素A的相互作用可预防新生小鼠缺氧缺血脑损伤
目的：
细胞凋亡过程中，AIF从线粒体释放到胞质并与CypA结合后转移至细胞核并导致细胞染色质断裂；通过抑制该复合物的形成可以防止由氧化应激诱导的内源性细胞凋亡。本研究的目的是在体内水平探讨AIF/CypA复合物抑制剂的使用是否对新生小鼠HI脑损伤具有神经保护作用。
方法:
本研究采用P9C57BL/6小鼠制作HI脑损伤模型。实验中分别在缺血前和缺氧后通过鼻腔给予AIF(370-394)-TAT肽段，随后分别在HI损伤后8小时、24小时和72小时收取小鼠脑组织样本，其中72小时样本用于脑损伤程度的评估，8小时和24小时样本则通过免疫组化、蛋白免疫印迹和ELISA等方法对潜在的分子机制进行研究。
结果:
HI脑损伤后，AIF(370-394)-TAT肽段治疗组小鼠脑组织梗塞体积比对照组小鼠减少48.1%，AIF(370-394)-TAT肽段治疗组小鼠皮层下白质损伤程度显著低于空白对照组小鼠；AIF(370-394)-TAT肽段可显著抑制HI后部分脑区的AIF核转移，影响HI后神经细胞死亡，对新生小鼠具有明显的神经保护作用。
结论:
AIF(370-394)-TAT肽段可以阻止AIF/CypA转移到细胞核，减少caspase非依赖性凋亡引起的神经元死亡，对新生小鼠HI脑损伤有保护作用。
具有高耗氧率和低含量抗氧化因子特征的新生儿大脑极易遭受氧化应激损伤。在HI刺激下，新生儿大脑中发生的氧化应激、兴奋性毒性和炎症反应等可激活多种不同细胞死亡，包括细胞凋亡(apoptosis)、坏死(necrosis)、坏死性凋亡(necroptosis)、铁坏死(ferroptosis)和自噬(autophagy)等。与成人相比，新生儿大脑更容易受到细胞凋亡的影响。新生儿HI损伤后神经元细胞的损失与凋亡导致的神经元死亡密切相关。
细胞凋亡诱导因子(Apoptosis inducing factor,AIF)是caspase非依赖凋亡途径中的关键因子之一。AIF具有调控细胞存活和死亡的双重作用，生理状态下，AIF位于线粒体膜间隙，在氧化磷酸化和活性氧清除过程中发挥至关重要的作用；在促凋亡信号的诱导下，AIF从线粒体释放并转移至细胞核，诱导染色质固缩和DNA片段化。前期研究表明，在小鼠HI脑损伤模型中，AIF蛋白水平的降低表现出显著的神经保护作用；AIF是新生小鼠大脑HI损伤后神经元丢失的主要原因。研究虽然证明降低AIF表达量可以有效抑制AIF参与的细胞凋亡途径，减轻脑损伤程度，但是AIF缺乏可同时导致线粒体功能障碍和细胞能量代谢失衡，引发一系列代谢问题。目前，对于AIF下调所带来的神经保护作用的具体机制并不十分清楚，因此，在HI动物模型中，从体内水平进一步探讨AIF在HIE中发挥保护作用的内在机制具有十分重要的意义。
随着对AIF蛋白结构和功能研究的不断深入，发现Aif基因外显子2存在两种不同亚型(2a和2b)，AIF蛋白同样存在两种不同亚型，分别为普遍存在且表达量最多的亚型AIF1和脑特异性表达亚型AIF2。两者由于外显子2所编码的氨基酸序列的不同，在功能和理化特性上存在一定差异。相较于AIF1，AIF2蛋白中由外显子2b所编码形成的结构域具有更强的疏水性，表现出对蛋白水解酶的抗性。与AIF1相比，AIF2可以更加稳固地锚定于线粒体内膜(IMM)，所以在促凋亡信号的刺激下，AIF2比AIF1更难以从线粒体中释放并参与之后的凋亡途径。目前对于AIF1的研究最为普遍和深入，但对AIF2的探讨却并不多。因此，作为在脑组织中特异性表达和存在的AIF2，明确其在HI脑损伤中的作用将有助于我们更加深入理解AIF在HIE中的作用机制。
在促凋亡信号的刺激下，AIF从线粒体释放后需转移至细胞核中方能发挥其裂解染色质和使DNA片段化的作用。关于AIF具体的核转移机制仍不是十分清楚，研究表明AIF与亲环素A(CypA)相互作用并共同易位至细胞核。AIF诱导的神经元死亡需要AIF与CypA形成复合物后共同易位至细胞核。因此，以AIF/CypA复合物为靶点，通过抑制该复合物的形成和核转移或许将会是一种减轻HI后神经元损伤的策略。
本研究将分别采用AIF过表达和AIF2敲除转基因小鼠，通过构建新生小鼠HI脑损伤模型，从基因和蛋白水平探索AIF在HI诱导的脑损伤发生发展中的作用机制，同时探索抑制AIF核转移所表现出的脑保护作用，为HIE的预防和治疗提供新的措施。
第一部分 凋亡诱导因子过表达加重新生小鼠缺氧缺血性脑损伤
目的：
前期研究表明AIF下调可以显著降低HI诱导的脑损伤程度，但是因为AIF下调可同时导致线粒体功能障碍和细胞的能量代谢失衡，并引发一系列代谢问题，目前对于AIF下调脑保护作用的机制并不是十分清楚。本实验通过构建AIF过表达转基因小鼠而上调AIF表达量，研究AIF在新生小鼠HI脑损伤中的作用机制。
方法：
本实验基于LoxP-Cre系统构建AIF过表达转基因小鼠，使用出生后9天（P9）的AIF过表达小鼠制作HI脑损伤模型，随后分别在HI损伤后24小时和72小时收取小鼠脑组织样本，其中72小时样本用于脑损伤程度的评估，24小时样本则通过免疫组化、蛋白免疫印迹、ELISA和RT-qPCR等方法对潜在的分子机制进行探讨。
结果：
生理状态下，AIF过表达小鼠具有正常的表型，未发现表型的变化和生理功能的改变；在HI脑损伤病理状态下，AIF-Tg小鼠脑组织梗塞体积比WT小鼠增加74.6%，AIF过表达显著加重新生小鼠HI脑损伤；AIF过表达可导致HI后脑组织各区域AIF核转移的显著增多以及部分脑区caspase-3阳性细胞密度的升高；AIF过表达对线粒体相关蛋白的表达以及线粒体动力学没有显著影响。
结论：
1.AIF过表达对小鼠的表型及生理功能无明显影响。
2.AIF过表达可显著加重新生小鼠HI脑损伤程度，这与AIF从线粒体释放并转移至细胞核，以及特定脑区caspase-3的活化相关。
第二部分 凋亡诱导因子脑特异性亚型缺失加重新生小鼠缺氧缺血脑损伤
目的：
AIF2是一种脑组织特异性表达的亚型。与普遍存在的AIF1相比，AIF2蛋白中由外显子2b编码的氨基酸序列所形成的结构域具有更强的疏水性和蛋白酶抗性，因此，在损伤刺激后AIF2可以更稳固的锚定于线粒体IMM上而不会被轻易释放。本研究的目的是通过构建AIF2敲除小鼠并制备HI脑损伤模型，探讨AIF2在新生小鼠HI脑损伤模型中的功能特征。
方法：
本实验采用LoxP-Cre系统构建AIF2敲除(AIF2KO)转基因小鼠并使用P9AIF2KO小鼠制作HI脑损伤模型，分别在HI损伤后6小时、24小时和72小时留取小鼠脑组织样本，其中72小时样本用于脑损伤程度的评估，6小时和24小时样本则通过免疫组化、蛋白免疫印迹、ELISA和RT-qPCR等方法对潜在的分子机制进行研究。
结果：
AIF2KO小鼠在生理状态下未发现明显的表型异常；AIF2敲除对于脑组织中线粒体的呼吸功能没有显著影响；但是，AIF2敲除可显著增强HI后大脑的氧化应激反应，加重新生小鼠HI脑损伤；HI脑损伤后，AIF2KO小鼠脑组织中MDA的含量是WT小鼠的2.05倍，AIF2KO小鼠小鼠脑组织梗塞体积比WT小鼠增加37.6%；对细胞死亡途径的研究结果显示，AIF2敲除对caspase依赖和caspase非依赖细胞死亡途径没有显著影响。
结论：
1.AIF2敲除小鼠的表型未见异常。
2.AIF2敲除可引起AIF1表达的代偿性增加，并且AIF1/AIF2比值的变化可增强氧化应激反应和加重新生小鼠HI脑损伤程度。
第三部分 抑制凋亡诱导因子与亲环素A的相互作用可预防新生小鼠缺氧缺血脑损伤
目的：
细胞凋亡过程中，AIF从线粒体释放到胞质并与CypA结合后转移至细胞核并导致细胞染色质断裂；通过抑制该复合物的形成可以防止由氧化应激诱导的内源性细胞凋亡。本研究的目的是在体内水平探讨AIF/CypA复合物抑制剂的使用是否对新生小鼠HI脑损伤具有神经保护作用。
方法:
本研究采用P9C57BL/6小鼠制作HI脑损伤模型。实验中分别在缺血前和缺氧后通过鼻腔给予AIF(370-394)-TAT肽段，随后分别在HI损伤后8小时、24小时和72小时收取小鼠脑组织样本，其中72小时样本用于脑损伤程度的评估，8小时和24小时样本则通过免疫组化、蛋白免疫印迹和ELISA等方法对潜在的分子机制进行研究。
结果:
HI脑损伤后，AIF(370-394)-TAT肽段治疗组小鼠脑组织梗塞体积比对照组小鼠减少48.1%，AIF(370-394)-TAT肽段治疗组小鼠皮层下白质损伤程度显著低于空白对照组小鼠；AIF(370-394)-TAT肽段可显著抑制HI后部分脑区的AIF核转移，影响HI后神经细胞死亡，对新生小鼠具有明显的神经保护作用。
结论:
AIF(370-394)-TAT肽段可以阻止AIF/CypA转移到细胞核，减少caspase非依赖性凋亡引起的神经元死亡，对新生小鼠HI脑损伤有保护作用。