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目的Nam Dinh virus(以下简称NDiV)是近年新发现的虫媒病毒,本课题组在国内首次成功从成蚊中分离,但该病毒流行病学意义和检测方法尚鲜见报道。本次研究拟建立一种特异、快速检测成蚊中NDiV的实时荧光定量PCR方法,为环境中的蚊虫携带NDiV的状况提供快速检测的方法提供参考。通过动物试验了解NDiV其致病作用,为指导虫媒传染病的控制提供依据。方法用C6/36细胞培养Nam Dinh病毒,待4-6天出现明显细胞病变时离心纯化病毒,50%细胞终点法测定病毒滴度。将已测定滴度的NDiV分离物分别在蚊虫细胞(C6/36细胞)和哺乳动物细胞培养,观察NDiV在不同细胞的生长状况。动物实验:(a)3-4日龄乳鼠,分组处理后在乳鼠脑部、腹腔和鼻腔接种不同剂量的病毒分离液,观察乳鼠接种病毒后的发病情况并作记录,提取发病组织研磨液核酸做RT-PCR检测并做病毒鉴定。(b)6日龄SPF鸡胚,分组处理后在SPF鸡胚卵黄囊、尿囊腔、羊膜腔接种不同剂量的病毒分离液,观察其孵育情况。(c)雏鸡,分组处理后在雏鸡的脑内接种、翅膀刺种和口服的途径接种病毒分离液,记录出现症状的雏鸡数。收集乳鼠和鸡胚的发病部位或组织,研磨后提取核酸做RT-PCR检测。以上实验均设立对照组。分析NCBI中的越南和中国的NDiV病毒株全序列特征,选取保守区域RdRp基因,设计NDiV的特异性引物与TaqMan-MGB探针,通过优化试验后验证所建立方法的特异性、敏感性、稳定性和应用性。建立特异性高、灵敏度强的实时荧光PCR快速检测方法。结果利用建立的RT-PCR方法检测NDiV分离物在蚊虫细胞(C6/36细胞)和哺乳动物细胞随时间的生长情况,检测结果显示病毒只在蚊虫细胞中有增殖,在哺乳动物细胞中无生长。NDiV对C6/36细胞有明显的病变效应,C6/36细胞是NDiV的敏感细胞;经C6/36细胞50%终点法计算得出NDiV病毒滴度为:1.41×106PFU/ml。乳鼠、鸡胚和雏鸡的不同部位经不同剂量的NDiV染毒后,没有出现明显的发病情况。通过多次的优化试验首次建立了NDiV MGB探针RT-PCR的检测方法。该检测方法用时短,灵敏度高,最低检测下限为1PFU/ml。该方法有良好的特异性,与登革热1-4血清型病毒、流行性乙型脑炎病毒、轮状病毒、人呼吸道合胞病毒、腺病毒、星状病毒无交叉反应;4份核酸含量不同的NDiV标准品重复测5次,Ct值的变异系数范围在1.67%~3.68%,有较高的稳定性。通过检测,龙岗区蚊虫NDiV携带率为18%,以居民区、医院和场馆的蚊虫携带NDiV比例最高,分别为22%、25%、31%。其它区域蚊虫携带NDiV比例较低。结论C6/36细胞是NDiV感染的敏感细胞,NDiV在C6/36细胞能产生病变效应,但病毒在哺乳类动物细胞未见增殖。通过实验观察发现,NDiV对乳鼠及鸡胚没有明显的致病作用。NDiV的TaqMan-MGB探针RT-PCR方法是一种特异、快速、灵敏高及稳定性好的方法,可应用于NDiV的流行病学监测工作,提高该病毒的快速检测的能力。