研究背景脊髓是疼痛信息传递和整合的初级中枢,脊髓背角小胶质细胞监测到周围神经损伤后迅速激活,释放细胞因子等多种物质,在神经病理性疼痛的发生、发展中发挥关键作用。最近研究报道坐骨神经部分损伤(Spared Nerve Injury,SNI)大鼠脊髓背角转录组测序提示ChREBP的表达增高。但ChREBP的表达增加是否与神经病理性疼痛(Neuropathic Pain,NPP)有关,目前尚未见报道。另有研究发现巨噬细胞中ChREBP蛋白具有显著的抑制炎症作用。那么,巨噬细胞样的小胶质细胞中ChREBP蛋白是否同样具有显著的抗炎作用,脊髓背角ChREBP是否通过调控炎症反应介导NPP的发生发展,目前尚不清楚。本研究以脊髓背角小胶质细胞介导的炎症反应为切入点,通过基因工程技术和生物信息学方法,探究ChREBP在NPP发生发展中的作用及其分子机制,为NPP的治疗提供新的作用靶点。方法第一章:构建并验证SNI诱导机械痛敏的大鼠模型。应用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)、免疫印迹和免疫荧光检测SNI术前、术后患侧L4-L6脊髓背角ChREBP的表达变化,并应用免疫荧光检测脊髓背角ChREBP的细胞定位。第二章:采用脊髓立体定向显微注射方法(以下简称显微注射)递送干扰ChREBP腺相关病毒或对照载体,并在注射后第28天进行SNI造模。在SNI术后第7天,应用qPCR、免疫印迹和免疫荧光等方法检测脊髓背角ChREBP表达变化。应用qPCR和疼痛行为学观察敲低ChREBP对脊髓背角炎症因子和机械痛敏的影响。第三章:采用显微注射方法递送编码ChREBP腺相关病毒或对照载体,并在注射后第28天进行SNI造模。在SNI术后第7天,应用qPCR、免疫印迹和免疫荧光等方法检测脊髓背角ChREBP的表达变化。应用qPCR和疼痛行为学观察过表达ChREBP对脊髓背角炎症因子和机械痛敏的影响。第四章:应用生物信息学方法预测ChREBP的上游转录因子及其潜在结合位点。ChREBP启动子全长报告质粒和包含预测结合位点片段化的报告质粒分别与编码预测靶基因(cJun)的质粒和小胶质细胞共转染后行双荧光素酶实验。编码cJun质粒或对照质粒分别转染小胶质细胞,随后应用染色质免疫共沉淀-qPCR(ChIP-qPCR)、琼脂糖凝胶电泳检测cJun抗体免疫沉淀富集到的ChREBP启动子片段的丰度。第五章:应用qPCR、免疫印迹和免疫荧光检测SNI术后cJun的表达变化。SNI术后鞘内注射cJun小干扰RNA,在伴或不伴过表达ChREBP的情况下,检测脊髓背角cJun、ChREBP、炎症因子以及50%PWT的变化。此外,在SNI术后鞘内注射编码cJun慢病毒,在伴或不伴敲低ChREBP的情况下,检测脊髓背角cJun、ChREBP、炎症因子以及50%PWT的变化。第六章:在LPS诱导小胶质细胞活化模型中:①敲低和上调ChREBP的表达,应用酶联免疫吸附试验检测炎症因子的变化;②敲低和上调cJun的表达检测ChREBP和炎症因子的变化。结果ChREBP蛋白在SNI术后的同侧L4-L6脊髓背角表达增加,并且与小胶质细胞标志物IBA-1及神经元标记物NeuN共标。显微注射干扰ChREBP腺相关病毒敲低脊髓背角ChREBP的表达,加剧脊髓背角的炎症反应和机械痛敏。相反,显微注射编码ChREBP腺相关病毒上调脊髓背角ChREBP的表达,改善脊髓背角的炎症反应和机械痛敏。cJun上调ChREBP启动子区结合位点3荧光素酶报告基因的荧光活性,并且cJun抗体免疫沉淀富集到更多的ChREBP启动子区结合位点3的片段。敲低SNI大鼠脊髓背角cJun的表达抑制ChREBP的表达和炎症反应,同时过表达ChREBP则进一步抑制炎症反应。上调SNI大鼠脊髓背角cJun的表达促进ChREBP的表达和炎症反应,同时下调ChREBP则进一步促进炎症反应。免疫荧光双染显示cJun和ChREBP共定位。在LPS诱导小胶质细胞活化模型下,上调ChREBP抑制炎症反应,下调ChREBP促进炎症反应;而上调cJun促进ChREBP的表达和炎症反应,下调cJun抑制ChREBP的表达和炎症反应。结论周围神经损伤激活脊髓背角cJun的表达。cJun一方面直接促进脊髓背角小胶质细胞源性的炎症反应引起神经病理性疼痛;另一方面激活脊髓背角ChREBP的转录,ChREBP反过来抑制炎症反应进而改善神经病理性疼痛。脊髓背角ChREBP通过抑制神经炎症为NP的发生和发展提供了保护机制。靶向脊髓背角ChREBP可能是治疗NPP的新目标和有效策略。