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研究背景
三氯生（TCS）作为一种普遍使用的抗菌剂已经在世界各地内得到广泛的推广应用，尽管已经在全球范围内拥有了近50年的使用经历，但是有大量文献报道，随着其大量频繁使用，伴随污水进入环境，给环境质量和人类健康造成了严重威胁。本研究在在前期转录组深度测序的基础上，利用模式生物斑马鱼对其进行了慢性暴露的毒性研究，着手分析三氯生长期暴露对斑马鱼肠道菌群的影响，从肠道菌群紊乱诱发斑马鱼脂肪代谢异常、运动行为和免疫系统等病变来探究TCS对斑马鱼致毒的分子机制，正确评价环境中TCS污染的生态风险。该研究将会增进对污染性疾病的认识，使环境污染预防、早期干预治疗成为可能，同时也为畜牧养殖业的优质发展提供参考。
研究目的
本研究首先构建了TCS长期暴露的斑马鱼品系，伴随益生菌（LactobacillusplantarumST-Ⅲ）和益生菌活性产物（胆盐水解酶）粗提取物长期喂养作为阳性对照，测定了TCS暴露下斑马鱼基本生理指征和运动行为的变化，运用HE、油红O等染色、相关生理生化指标的测定及一系列分子生物学的技术和手段（qRT-PCR、W-ISH和IF）对TCS暴露造成的病理损伤和免疫相关基因表达量进行了分子验证，并利用16srDNA高通量测序技术检测TCS和益生菌饮食对斑马鱼肠道微生物种类和菌群结构的影响，从表观病理学到分子病理学的阐明，并辅助于TCS长期胁迫下菌群结构紊乱的佐证，深入而系统地探讨TCS的致毒机理。另外，在上述研究的基础上，证明TCS的暴露会导致斑马鱼免疫系统毒性的前提下，通过苏丹黑和中性红等染色技术检测了TCS暴露下斑马鱼胚胎早期粒细胞的变化，针对转录组深度测序的数据进行生物信息分析，候选miR-19a作为目的标miRNA调控分子，利用斑马鱼幼鱼可视化操作的优势，探索了TCS暴露下免疫系统损伤的具体机制。
研究内容
1.根据相关文献并参考前期研究和污染物的环境监测浓度，选择合适的TCS药物暴露浓度（200μg/L）和益生菌饮食（1×108CFU/mL）饲喂剂量，从胚胎6dpf开始到90dpf进行TCS的暴露和益生菌饮食处理，构建TCS慢性暴露和益生菌饮食复合处理的斑马鱼品系。
2.利用16srDNA测序，检测TCS暴露对斑马鱼肠道菌群多样性的影响和干扰；同时，解剖各处理组的斑马鱼，并测定斑马鱼体重、体长等基本的生理指标和BMI指数，并通过HE和油红O染色以及对肝脏甘油三脂和总胆固醇含量的检测来分析TCS暴露对斑马鱼肝脏脂肪代谢影响；对TCS长期暴毒的成年斑马鱼脾脏、肾脏和肠道进行HE染色，分析TCS长期暴露对斑马鱼体内主要免疫器官的损伤，并对肠道MDA含量进行检测，分析肠道粘膜过氧化损伤的程度。
3.基于机体肠道菌群结构平衡与思维、心情和行为习惯密切关联的崭新热点问题，通过栖底运动试验、T迷宫试验和社交试验对TCS长期处理成年斑马鱼的运动行为进行检测，分析污染物对肠道菌群结构的干扰是否造成其致毒的机制之一。
4.提取成鱼肠道总RNA，利用qRT-PCR技术检测斑马鱼肠道免疫相关基因表达量的变化；运用免疫荧光技术（IF）检测肠道和肝脏CD4+和溶酶体表达量的变化，从蛋白水平分析TCS暴露对斑马鱼肠道和肝脏造成免疫损伤的分子机制。
5.在上述研究证明TCS暴露对免疫系统损伤的基础上，设定TCS急性暴露浓度，利用苏丹黑和中性红染色技术分析TCS暴露下斑马鱼早期胚胎（3-4dpf）参与造血和免疫调节的粒细胞的数量变化；基于前期转录组测序和生物信息学分析，筛选TCS暴露下差异表达并调控免疫相关靶基因的高丰度miR-19a，设计合成相应的Agomir和Antagomir并通过显微注射技术增强或抑制斑马鱼体内miR-19a的表达后，检测参与早期固有免疫的相关因子的表达量，运用原位杂交技术直观检测两个调控早期造血和免疫相关功能的基因（spi1,nod1）的表达量变化，从分子角度深入研究TCS暴露影响斑马鱼早期固有免疫系统的转录后调控机制。
研究结果
1.16SrDNA测序结果发现，TCS长期暴露导致斑马鱼肠道菌群内变形菌门(Proteobacteria)的丰度远远大于其他处理组，而拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度则明显减少，同时，和益生菌饮食组以及对照组相比，TCS暴露组肠道菌群的多样性也降低了；菌群结构相似性的分析结果显示益生菌饮食组（LAB,TL）在菌群结构组成上更接近于对照组，TCS暴露组则聚类在另一边，表现出和对照组菌群结构更多不同的组成，说明TCS长期暴露对影响了斑马鱼肠道菌群，使其多样性受到损害。。
2.对成年斑马鱼的肝脏HE和油红O的染色以及脂肪含量测定结果表明，TCS暴露下，肝细胞狭窄并且结构不清晰，细胞间隙增大，炎症浸润，肝脏脂滴堆积，甘油三脂、总胆固醇含量的含量显著升高。这些结果表明，TCS长期暴露可能导致斑马鱼产生非酒精性脂肪肝，同时，益生菌饮食能有效缓解脂肪代谢紊乱的作用。
3.对成年斑马鱼主要免疫器官（肠道、脾脏和肾脏）的HE染色，发现TCS暴露组肾脏组织水肿、脾脏细胞异常和肠道粘膜受损，同时益生菌饮食组作为阳性对照，其组织结构均正常，表明长期TCS暴露严重破坏了斑马鱼主要免疫器官的组织结构，而益生菌饮食能够有效缓解这种损伤；肠道组织的丙二醛含量检测发现，TCS暴露导致斑马鱼肠道产生了脂质过氧化损伤。
4.行为学的实验分析表明，TCS暴露使斑马鱼的学习记忆能力明显降低，焦虑水平升高，益生菌饮食能部分缓解TCS暴露导致的记忆障碍和焦虑行为，而斑马鱼的社交行为的没有受到影响。
5.免疫荧光检测发现，TCS暴露组肠道CD4+T淋巴细胞显著增加(图3-4H)，肝脏LAMP1阳性抗体数量增多，表明TCS对斑马鱼肝脏和肠道的产生明显的炎症损伤;TCS浓度梯度急性暴露的胚胎中性红和苏丹黑染色表明，TCS暴露导致斑马鱼胚胎粒细胞增多，可能激活早期免疫应答产生炎症反应。
6.基于转录组高通量测序数据的前期工作，通过生物信息学分析筛选和验证了TCS暴露下差异表达的dre-miR-19a作为研究对象，实现Agomir-19a和Antagomir-19a的功能过表达或敲降后，发现抑制了miR-19a的表达后，促炎因子的表达量显著上升，粒细胞染色阳性颗粒明显增多，调控斑马鱼早期固有免疫的两个关键基因表达量也显著降低了，表明miR-19a可能参与斑马鱼胚胎早期固有免疫的转录后调控，是影响斑马鱼免疫系统的关键miRNA分子。
结论
本文首先对TCS长期暴露和益生菌饮食复合处理斑马鱼进行16SrDNA高通量测序技术检测，发现TCS暴露会破坏斑马鱼肠道菌群的多样性，同时，斑马鱼基本体征的测定发现TCS长期处理的斑马鱼BMI显著增加，呈肥胖表征，肝脏的HE和油红O以及脂质测定结果表明，TCS暴露会引起斑马鱼脂肪代谢紊乱和肝脏脂质堆积。为了探索菌群多样性对脑肠轴的影响，我们通过对成年斑马鱼运动行为的观察，发现慢性TCS暴露会造成斑马鱼记忆能力减退和焦虑行为，而且也会造成肠道和肝脏的免疫反应和炎症损伤，并且在对TCS暴露的斑马鱼进行转录组高通量深度测序后发现，miR-19a可能是调控TCS暴露下斑马鱼早期固有免疫的关键miRNA分子。综上，本研究系统评估了TCS暴露对斑马鱼的综合毒性效应，并且对肠道菌群紊乱和免疫系统损伤产生的分子机制展开探索分析，为正确评估TCS环境暴露潜在的健康风险提供了理论依据。
三氯生（TCS）作为一种普遍使用的抗菌剂已经在世界各地内得到广泛的推广应用，尽管已经在全球范围内拥有了近50年的使用经历，但是有大量文献报道，随着其大量频繁使用，伴随污水进入环境，给环境质量和人类健康造成了严重威胁。本研究在在前期转录组深度测序的基础上，利用模式生物斑马鱼对其进行了慢性暴露的毒性研究，着手分析三氯生长期暴露对斑马鱼肠道菌群的影响，从肠道菌群紊乱诱发斑马鱼脂肪代谢异常、运动行为和免疫系统等病变来探究TCS对斑马鱼致毒的分子机制，正确评价环境中TCS污染的生态风险。该研究将会增进对污染性疾病的认识，使环境污染预防、早期干预治疗成为可能，同时也为畜牧养殖业的优质发展提供参考。
研究目的
本研究首先构建了TCS长期暴露的斑马鱼品系，伴随益生菌（LactobacillusplantarumST-Ⅲ）和益生菌活性产物（胆盐水解酶）粗提取物长期喂养作为阳性对照，测定了TCS暴露下斑马鱼基本生理指征和运动行为的变化，运用HE、油红O等染色、相关生理生化指标的测定及一系列分子生物学的技术和手段（qRT-PCR、W-ISH和IF）对TCS暴露造成的病理损伤和免疫相关基因表达量进行了分子验证，并利用16srDNA高通量测序技术检测TCS和益生菌饮食对斑马鱼肠道微生物种类和菌群结构的影响，从表观病理学到分子病理学的阐明，并辅助于TCS长期胁迫下菌群结构紊乱的佐证，深入而系统地探讨TCS的致毒机理。另外，在上述研究的基础上，证明TCS的暴露会导致斑马鱼免疫系统毒性的前提下，通过苏丹黑和中性红等染色技术检测了TCS暴露下斑马鱼胚胎早期粒细胞的变化，针对转录组深度测序的数据进行生物信息分析，候选miR-19a作为目的标miRNA调控分子，利用斑马鱼幼鱼可视化操作的优势，探索了TCS暴露下免疫系统损伤的具体机制。
研究内容
1.根据相关文献并参考前期研究和污染物的环境监测浓度，选择合适的TCS药物暴露浓度（200μg/L）和益生菌饮食（1×108CFU/mL）饲喂剂量，从胚胎6dpf开始到90dpf进行TCS的暴露和益生菌饮食处理，构建TCS慢性暴露和益生菌饮食复合处理的斑马鱼品系。
2.利用16srDNA测序，检测TCS暴露对斑马鱼肠道菌群多样性的影响和干扰；同时，解剖各处理组的斑马鱼，并测定斑马鱼体重、体长等基本的生理指标和BMI指数，并通过HE和油红O染色以及对肝脏甘油三脂和总胆固醇含量的检测来分析TCS暴露对斑马鱼肝脏脂肪代谢影响；对TCS长期暴毒的成年斑马鱼脾脏、肾脏和肠道进行HE染色，分析TCS长期暴露对斑马鱼体内主要免疫器官的损伤，并对肠道MDA含量进行检测，分析肠道粘膜过氧化损伤的程度。
3.基于机体肠道菌群结构平衡与思维、心情和行为习惯密切关联的崭新热点问题，通过栖底运动试验、T迷宫试验和社交试验对TCS长期处理成年斑马鱼的运动行为进行检测，分析污染物对肠道菌群结构的干扰是否造成其致毒的机制之一。
4.提取成鱼肠道总RNA，利用qRT-PCR技术检测斑马鱼肠道免疫相关基因表达量的变化；运用免疫荧光技术（IF）检测肠道和肝脏CD4+和溶酶体表达量的变化，从蛋白水平分析TCS暴露对斑马鱼肠道和肝脏造成免疫损伤的分子机制。
5.在上述研究证明TCS暴露对免疫系统损伤的基础上，设定TCS急性暴露浓度，利用苏丹黑和中性红染色技术分析TCS暴露下斑马鱼早期胚胎（3-4dpf）参与造血和免疫调节的粒细胞的数量变化；基于前期转录组测序和生物信息学分析，筛选TCS暴露下差异表达并调控免疫相关靶基因的高丰度miR-19a，设计合成相应的Agomir和Antagomir并通过显微注射技术增强或抑制斑马鱼体内miR-19a的表达后，检测参与早期固有免疫的相关因子的表达量，运用原位杂交技术直观检测两个调控早期造血和免疫相关功能的基因（spi1,nod1）的表达量变化，从分子角度深入研究TCS暴露影响斑马鱼早期固有免疫系统的转录后调控机制。
研究结果
1.16SrDNA测序结果发现，TCS长期暴露导致斑马鱼肠道菌群内变形菌门(Proteobacteria)的丰度远远大于其他处理组，而拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度则明显减少，同时，和益生菌饮食组以及对照组相比，TCS暴露组肠道菌群的多样性也降低了；菌群结构相似性的分析结果显示益生菌饮食组（LAB,TL）在菌群结构组成上更接近于对照组，TCS暴露组则聚类在另一边，表现出和对照组菌群结构更多不同的组成，说明TCS长期暴露对影响了斑马鱼肠道菌群，使其多样性受到损害。。
2.对成年斑马鱼的肝脏HE和油红O的染色以及脂肪含量测定结果表明，TCS暴露下，肝细胞狭窄并且结构不清晰，细胞间隙增大，炎症浸润，肝脏脂滴堆积，甘油三脂、总胆固醇含量的含量显著升高。这些结果表明，TCS长期暴露可能导致斑马鱼产生非酒精性脂肪肝，同时，益生菌饮食能有效缓解脂肪代谢紊乱的作用。
3.对成年斑马鱼主要免疫器官（肠道、脾脏和肾脏）的HE染色，发现TCS暴露组肾脏组织水肿、脾脏细胞异常和肠道粘膜受损，同时益生菌饮食组作为阳性对照，其组织结构均正常，表明长期TCS暴露严重破坏了斑马鱼主要免疫器官的组织结构，而益生菌饮食能够有效缓解这种损伤；肠道组织的丙二醛含量检测发现，TCS暴露导致斑马鱼肠道产生了脂质过氧化损伤。
4.行为学的实验分析表明，TCS暴露使斑马鱼的学习记忆能力明显降低，焦虑水平升高，益生菌饮食能部分缓解TCS暴露导致的记忆障碍和焦虑行为，而斑马鱼的社交行为的没有受到影响。
5.免疫荧光检测发现，TCS暴露组肠道CD4+T淋巴细胞显著增加(图3-4H)，肝脏LAMP1阳性抗体数量增多，表明TCS对斑马鱼肝脏和肠道的产生明显的炎症损伤;TCS浓度梯度急性暴露的胚胎中性红和苏丹黑染色表明，TCS暴露导致斑马鱼胚胎粒细胞增多，可能激活早期免疫应答产生炎症反应。
6.基于转录组高通量测序数据的前期工作，通过生物信息学分析筛选和验证了TCS暴露下差异表达的dre-miR-19a作为研究对象，实现Agomir-19a和Antagomir-19a的功能过表达或敲降后，发现抑制了miR-19a的表达后，促炎因子的表达量显著上升，粒细胞染色阳性颗粒明显增多，调控斑马鱼早期固有免疫的两个关键基因表达量也显著降低了，表明miR-19a可能参与斑马鱼胚胎早期固有免疫的转录后调控，是影响斑马鱼免疫系统的关键miRNA分子。
结论
本文首先对TCS长期暴露和益生菌饮食复合处理斑马鱼进行16SrDNA高通量测序技术检测，发现TCS暴露会破坏斑马鱼肠道菌群的多样性，同时，斑马鱼基本体征的测定发现TCS长期处理的斑马鱼BMI显著增加，呈肥胖表征，肝脏的HE和油红O以及脂质测定结果表明，TCS暴露会引起斑马鱼脂肪代谢紊乱和肝脏脂质堆积。为了探索菌群多样性对脑肠轴的影响，我们通过对成年斑马鱼运动行为的观察，发现慢性TCS暴露会造成斑马鱼记忆能力减退和焦虑行为，而且也会造成肠道和肝脏的免疫反应和炎症损伤，并且在对TCS暴露的斑马鱼进行转录组高通量深度测序后发现，miR-19a可能是调控TCS暴露下斑马鱼早期固有免疫的关键miRNA分子。综上，本研究系统评估了TCS暴露对斑马鱼的综合毒性效应，并且对肠道菌群紊乱和免疫系统损伤产生的分子机制展开探索分析，为正确评估TCS环境暴露潜在的健康风险提供了理论依据。