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非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus,ASFV)感染引起的危害养猪业的重大动物疫病,该病在急性期表现出不同的临床症状,病死率高达100%,迄今为止依然没有有效的疫苗及治疗方案。ASFV pS273R蛋白是一种特殊的SUMO-1样半胱氨酸蛋白酶,具有高度的保守性,能够将ASFV p P220和p P62蛋白分解成多个成熟的衣壳蛋白,参与病毒粒子核衣壳的组装,在ASFV复制过程中发挥重要作用。因此筛选能够抑制ASFV pS273R蛋白酶活性的药物,抑制ASFV核衣壳的组装,形成不具有感染性的病毒粒子,对于非洲猪瘟综合防治具有重要意义。本研究首先构建ASFV pS273R蛋白的原核与真核表达载体,通过Modeller 9.20软件对ASFV Georgia 2007/1株pS273R蛋白的晶体结构进行预测分析,再结合Inter Pro网站的数据筛选出针对pS273R蛋白的小分子靶向抑制剂。通过小分子抑制剂和pS273R蛋白进行分子对接、共价对接和体外验证实验综合评价小分子抑制剂对pS273R蛋白酶活性中心靶向抑制的特点。SDS-PAGE和Western Blot实验鉴定结果显示成功表达了ASFV pS273R重组蛋白。筛选出的小分子抑制剂E-64的14号碳原子可与pS273R蛋白残基CYS232形成稳定的C-S共价键,还同时形成7个氢键作为辅助结合。将重组载体Flag-pS273R和重组载体HA-p P62共转染进293T细胞,在不同浓度的E-64抑制剂作用下,利用Western Blot技术检测小分子抑制剂E-64对ASFV pS273R蛋白酶活性的抑制效果,结果显示4 m M浓度的E-64抑制剂能够抑制pS273R蛋白酶活性,并且添加4 m M E-64抑制剂后的细胞形态规则无过量死亡细胞,细胞活力为101.86%,表明4 m M E-64抑制剂不会对293T细胞造成细胞毒性。荧光定量PCR检测结果显示ASFV pS273R蛋白转染293T细胞后能够下调细胞免疫因子IFN-γ和IL-12的m RNA转录水平,与转染空白载体相比差异极显著(P<0.01);添加4 m M E-64抑制剂能够上调细胞免疫因子IL-12、IFN-γ和IFN-α的m RNA转录水平,与转染ASFV pS273R蛋白相比IL-12差异极显著(P<0.01),IFN-γ和IFN-α差异显著(P<0.05)。综上所述,小分子抑制剂E-64能够从细胞水平抑制ASFV pS273R活性,并且不影响细胞的生物学活性。本研究为非洲猪瘟药物开发提供新思路,为全面了解ASFV pS273R蛋白的结构功能和药物靶标的筛选提供理论基础。