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第一部分 COX-2基因对卵巢癌细胞生物学特性的影响目的通过展示COX-2对人卵巢癌CAOV-3细胞活性、迁移性、增殖性变化的影响,探讨COX-2基因的作用机制。方法以人卵巢癌CAOV-3细胞系,人卵巢癌组织及其相应的癌旁正常组织为材料,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹(Western-Blot)分别检测COX-2mRNA和蛋白质表达情况;以体外培养的人卵巢癌CAOV-3细胞作为研究对象,构建pcDNA-COX-2载体和COX-2 siRNA载体,以无质粒载体的CAOV-3细胞作为阴性对照组。分别转染质粒48小时后,采用实时荧光定量PCR和Western-Blot分别检测COX-2mRNA和蛋白质表达情况,并采用WST-1和Transwell方法,观察随COX-2基因含量的变化,CAOV-3细胞的活性、迁移性变化,继续加入LY294002(PI3k的特异抑制剂)后,用Western-Blot 检测 CAOV-3 细胞内 COX-2 蛋白的变化,用 WST-1、Transwell、3H-TdR方法观察CAOV-3细胞活性、迁移性和增殖性的变化。结果与人卵巢癌旁非瘤组织相比,人卵巢癌组织中的COX-2mRNA和COX-2蛋白含量明显增高。WST-1法确定转染pcDNA-COX-2的CAOV-3细胞活性明显高于无质粒CAOV-3细胞,转染COX-2 siRNA载体的CAOV-3细胞沉默COX-2基因,COX-2基因过表达的CAOV-3细胞的活性、迁移性均显著增加,COX-2基因低表达的CAOV-3细胞的活性、迁移性均显著下降,继续加入LY294002后,不但COX-2蛋白质明显减少,CAOV-3细胞的活性、迁移性和增殖也降低。结论COX-2基因可通过PI3K/Akt通路实现增加CAOV-3细胞活性、迁移性和增殖性。第二部分 COX-2基因介导紫杉醇/卡铂致卵巢癌细胞凋亡的分子机制的论证目的:COX-2基因过表达在紫杉醇/卡铂致卵巢癌CAOV-3细胞凋亡的过程中,对CAOV-3细胞生物功能的影响,论证COX-2基因影响紫杉醇/卡铂致卵巢癌CAOV-3细胞凋亡作用的分子机制。方法:以人卵巢癌CAOV-3细胞作为研究对象,显微镜下观察紫杉醇/卡铂致CAOV-3细胞凋亡形态的变化,在不同时间段,采用实时荧光定量PCR法和Western-Blot法检测细胞COX-2mRNA和蛋白质的变化。转染COX-2cDNA质粒,以无质粒载体和空质粒作为阴性对照组,分别予以紫杉醇/卡铂作用CAOV-3细胞,通过WST-1、Transwell、3H-TdR方法检测各组CAOV-3细胞的活性、迁移性、增殖性的变化,用流式细胞仪、电镜检查细胞凋亡情况。各组再分别加入LY294002,AG490,用Western-Blot方法评估各组CAOV-3细胞内COX-2蛋白含量的变化,用WST-1、Transwell、3H-TdR方法,评估细胞活性、迁移性和增殖性的变化,用流式细胞仪、电镜检查观察细胞凋亡变化情况。结果:紫杉醇/卡铂诱导CAOV-3细胞凋亡过程中,COX-2mRNA和蛋白质表达呈时间依赖性的减少,若COX-2基因过表达后,则增加了 CAOV-3细胞的活性、迁移性、增殖性,逆转了紫杉醇/卡铂诱导的CAOV-3细胞凋亡现象。紫杉醇/卡铂+pCMV-COX-2+LY294002组活性AKT蛋白有明显减少,紫杉醇/卡铂+pCMV-COX-2+AG490组中活性Stat蛋白没有此现象。LY294002抑制COX-2基因高表达激活的PI3K/Akt通路后,明显降低紫杉醇/卡铂对CAOV-3细胞的毒性作用,即降低CAOV-3细胞活性、迁移性和增殖性,诱导细胞凋亡作用。结论:COX-2基因可通过PI3k/Akt通路,抑制紫杉醇/卡铂致CAOV-3细胞的凋亡。