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START(the lipid/sterol-binding StAR-related lipid transfer protein domains)保守结构域,是一种30Kda的可以结合和转运胆固醇到线粒体内膜的类固醇类调节蛋白,被定义为一个大约200个氨基酸序列,与脂类和甾醇类物质结合相关。拟南芥中含START结构域的蛋白质家族共有35个成员,根据结构和大小分为7个亚家族,其中含HD ZLZ START结构域的21个,含PH START DUF1336结构域的5个,仅含START结构域的9个。含START结构域的蛋白质已确定功能的有9个,分别为GL2、ANL2、PDF2、ATML1、FWA、PHV、PHB、ATHB-8、REV。上述已知功能的蛋白均为HDZLZ START结构域蛋白亚家族,分别调控皮层的发育(ATML1)、花器官形成(PDF2)、花青素积累(ANL2、FWA)、表皮毛生长(GL2)、近远轴极性(PHV、PHB、REV)、维管束建成(ATHB-8)的发育过程,而其他含有START结构域的蛋白功能尚未有文献报道。为进一步分析START结构域的功能,我们选择其中比较保守的,仅含有START结构域的PMRP蛋白作为研究对象。为阐明PMRP在植物生长发育过程中的作用,本研究对PMRP基因的功能进行分析。获得以下主要结果: 1.PMRP受油菜素内酯(Brassinosteroids,BRs)诱导。本研究用100μM的2,4-表油菜素内酯(eBL)处理生长4周的Col-0拟南芥,处理时间分别为3、6、9、12、18、24 h,RT-PCR结果表明,随着eBL处理时间的延长,PMRP基因的表达量逐渐升高,表明BR诱导PMRP基因的表达。 2.PMRP的表达模式分析 (1)构建PMRP启动子连接GUS报告基因的组织定位载体,对PMRP的组织定位进行分析,发现PMRP在整个幼苗均有表达,尤其在子叶和下胚轴中表达最多,在真叶中主要分布在叶脉和表皮毛发生部位,在根中的表达也很明显。(2)通过构建PMRP-GFP融合表达载体,并转化原生质体,对PMRP的亚细胞定位进行初步分析,发现PMRP主要位于细胞膜上,在细胞质中也有表达。(3)利用Real-time PCR技术,对PMRP基因在拟南芥的时空表达情况进行分析,发现PMRP在茎生叶中的表达量最高,其次是莲座叶、茎,而在根、花和种子中的表达量都较少。进一步的结果表明,PMRP基因在莲座叶、茎生叶、茎中的表达量随生长时间的增加而增加,而在根和整个地上部分中的表达基本处于一个比较稳定的状态。 3.PMRP的生物学功能分析 创制PMRP功能获得和缺失的转基因拟南芥,并对其表型进行分析,明确PMRP的生物学功能。(1)过表达PMRP的拟南芥叶片变大,根长变长;T-DNA插入突变体表现为矮小,突变体抽薹数少于野生型,且经常由一侧伸出主枝。表明PMRP对拟南芥的生长发育及极性建成过程中具有重要作用。(2)通过对叶片表皮细胞形态的观察发现,T-DNA插入突变体远轴面的细胞较野生型紧凑,表现出近轴化的特征;过表达PMRP的转基因拟南芥叶片近轴面的细胞出现了远轴面细胞的形态特征。进一步证明PMRP对极性建成的调控作用。(3)通过对过表达PMRP的转基因拟南芥叶片中的花青素含量分析表明,过表达PMRP的转基因拟南芥叶片中花青素的含量明显高于野生型拟南芥。表明PMRP参与花青素的代谢调控。 4.PMRP调控拟南芥生长发育的机制研究(1)PMTP调控拟南芥极性建成的机制分析。为明确PMRP调控极性建成的机制,本研究通过RT-PCR技术对PMRP的功能获得突变体中的极性相关基因的表达量进行分析,结果表明与叶片生长相关的WOX1、PRS基因表达量上升,控制维管束分化的REV的表达量也上升,而与植物近轴的分化相关的PHB基因的表达量下降。其他极性相关基因(ARF3、AS1、KANAD1、AE7、YABB Y2)表达量无明显变化。表明PMRP可能通过调控L述极性建成相关基因调控拟南芥的发育过程。(2)BR对拟南芥极性相关基因表达量的影响。本研究用100μM的2,4-表油菜素内酯(eBL)处理生长4周的Col-0拟南芥,处理时间分别为3、6、9、12、18、24h,RT-PCR结果表明,YABB Y2、FIL、AS1和WOX1基因的表达量先下降后上升,在处理12h时达到最低值。PHB和PHV基因的表达量持续下调,WOX2、AE7基因变化不明显,PRS、ARF3基因的表达量持续上升。其中PRS和PHB基因的表达量变化与PMRP功能获得突变体中的表达量变化一致。