【摘 要】
:
黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa densovirus, PfDNV)的非结构蛋白NS1是一个定位于细胞核中的多功能蛋白,对病毒DNA的复制很重要,具有ATP酶、位点特异性的DNA结合、解旋酶、转录激活等活性,以及细胞致病性。本论文研究了PfDNV NS1的内切核酸酶活性及磷酸化。最开始的时候,我们利用大肠杆菌表达并纯化了带MBP标签的NS1蛋白,没有发现内切核酸酶活
论文部分内容阅读
黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa densovirus, PfDNV)的非结构蛋白NS1是一个定位于细胞核中的多功能蛋白,对病毒DNA的复制很重要,具有ATP酶、位点特异性的DNA结合、解旋酶、转录激活等活性,以及细胞致病性。本论文研究了PfDNV NS1的内切核酸酶活性及磷酸化。最开始的时候,我们利用大肠杆菌表达并纯化了带MBP标签的NS1蛋白,没有发现内切核酸酶活性,于是我们改用了Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,在Sf9细胞中表达并纯化了N端融合了MBP的NS1蛋白,展现出了显著的内切核酸酶活性,并确定了切割位点,这种活性需要ATP和金属离子的辅助,缺一不可,同时,Mg2+的辅助作用强于Mn2+。NS1蛋白行使内切核酸酶功能时,与切割位点处5’端的胸腺嘧啶发生共价结合,根据相关文献推测,NS1的某个酪氨酸残基参与了这种共价结合过程。由于大肠杆菌表达纯化的NS1蛋白没有内切核酸酶活性,而Sf9细胞表达纯化的NS1蛋白却有活性,这使我们想到也许是翻译后的修饰造成了这种差异,特别是磷酸化修饰。于是,我们将Sf9细胞中表达纯化的NS1蛋白分别用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)、T细胞酪氨酸磷酸酶(TC PTP)和Lambda蛋白磷酸酶(Lambda PP)三种去磷酸化酶进行去磷酸化反应,纯化之后与未去磷酸化的NS1进行活性比较。经CIP和TC PTP处理的NS1蛋白失去了内切核酸酶活性,而经Lambda PP处理的NS1蛋白仍保有部分活性。这说明酪氨酸残基的磷酸化对NS1蛋白的内切核酸酶活性是很重要的。我们通过酪氨酸磷酸化特异性抗体的免疫印迹实验证实,Sf9细胞中表达纯化的NS1蛋白确实存在酪氨酸磷酸化,而大肠杆菌中表达纯化的NS1蛋白却没有。Genistein是一种广谱的酪氨酸激酶抑制剂,我们发现将表达NS1蛋白的Sf9细胞用不同浓度的genistein进行处理,获得的NS1蛋白的内切核酸酶活性表现出了不同程度的损失,这与去磷酸化实验的结果是一致的。为了识别NS1蛋白中被磷酸化的酪氨酸以及内切核酸酶的活性核心酪氨酸,我们利用重叠延伸PCR的方法构建了一系列突变,将NS1蛋白序列中保守性很强的酪氨酸残基突变成了苯丙氨酸残基,并在杆状病毒表达系统中表达纯化,在体外检测了这些突变型NS1蛋白的内切核酸酶、DNA特异性结合、解旋酶及ATP酶的活性,发现突变型Y86F、Y178F和Y345F的内切核酸酶活性均有异常,有可能是酪氨酸磷酸化的位点。其中,第86位酪氨酸与内切核酸酶切割位点的特异性有关;第178位酪氨酸是NS1蛋白内切核酸酶酶活性的核心酪氨酸:突变型Y345F失去内切核酸酶活性的同时,ATP酶和解旋酶的活性也完全丧失了。我们将真核表达纯化的NS1蛋白进行串联质谱分析,发现在NS1蛋白的第345位酪氨酸残基上发生了磷酸化,而第86位和第178位的酪氨酸并没有检测到磷酸化。第345位酪氨酸残基位于解旋酶保守结构域的附近,该位点的磷酸化可能与NS1解旋酶活性区域的正确折叠有关,突变后将导致解旋酶活性的丧失,从而影响了内切核酸酶活性。细小病毒科其它研究过的NS1蛋白中,一般都是在丝氨酸和苏氨酸残基上进行磷酸化的修饰,酪氨酸残基并不被磷酸化,而黑胸大蠊浓核病毒的NS1蛋白采用了酪氨酸残基磷酸化的模式来调节内切核酸酶的活性,这很特别,有助于进一步的理解病毒基因组复制调控的机制。
其他文献
与中国博物馆事业发展一样,中国博物馆文创起步较晚,但发展势态迅猛,社会效益凸显。国内博物馆文创产品开发实践,对中华传统文化进行传承、创新与发展,深入挖掘和拓展文物蕴含的历史、艺术、科学价值和时代精神,同时积极与市场对接,通过授权、合资、代销、定制等合作形式开展博物馆文创产品研发经营活动,从而更好地服务于我国精神文明与物质文明建设,丰富文化供给,促进文化消费,彰显中华文明独特魅力。
蛋白质是生物体最重要的组成成分,一旦蛋白质形成了错误的空间结构,直接导致其生物学功能的丧失或改变,继而引起众多相关疾病,迄今已发现有二十多种蛋白质的错误折叠与疾病相关。传染性海绵样脑病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)即所谓prion疾病(prion diseases)是一类慢性的、可在多种哺乳动物之间广泛传播的致死性中枢神经系统疾病
冰晶粒子虽然只占悬浮的水汽凝结体的很少部分,但它强烈影响地球辐射平衡和气候,以及云电极化和降水,是当前科学研究的重点。初始冰晶的形成是一种核化过程。目前冰晶的核化理论并不完善,特别是异质核化过程,受气溶胶和大气环境的影响。大气中冰晶形成过程极其复杂且未被完全认知,其内在的实际主导机制以及环境条件,气溶胶特征和冰晶进一步增长之间的清晰联系并未建立。当前对云内冰晶形成的外场观测很少,特别是初始的冰晶形
作为遗传信息的载体,DNA被广泛关注。单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸(A、T、G和C)的变异而引起的DNA序列多态性,对其相关研究如今已成为全世界科学研究人员广泛关注的热点。通过化学的手段,设计灵敏检测单碱基变化的核酸探针意义重大。细胞内的DNA合成是一个基本的生物细胞增殖的核心过程,定量监测DNA合成常被用于研究生物化学细胞周期、组织发育和再生、药效评判及其他许多重要的生
数十年内,拓扑物理成为了研究的热点。从早期的量子霍尔效应到反常量子霍尔效应、分数量子霍尔效应、自旋量子霍尔效应,出现了不受介质、杂质、缺陷、热扰动影响的量子化平台效应。最早,人们通过TKNN拓扑数将此量子化平台效应与拓扑联系起来。随后,人们又提出了更多新奇的拓扑效应,如拓扑绝缘体、拓扑超导、拓扑保护的Weyl费米子、Majorana费米子。他们共有的特性是扰动对他们的拓扑性质不会产生影响。拓扑效应
我们从水稻Nipponbare EMS突变体库中筛选得到一个生长发育受阻,根构型改变,不能利用Fe(Ⅲ)(柠檬酸-Fe(Ⅲ))的水稻突变体。通过图位克隆的方法,克隆到该突变基因为水稻Fe(Ⅲ)吸收代谢途径中合成DMA(麦根酸)的关键酶——OsNAAT1(LOCOs02g20360)。而DMA是用来螯合Fe(Ⅲ)以供植物根系吸收Fe的载体(Phytosiderophore),因而,该基因的突变使Os
随着计算机技术和互联网(Internet)的发展,地理信息系统(GIS)描述和分析地球空间上的各类信息的方法和处理手段也发生了很大变化,产生了很多相应的网络GIS产品。GIS逐步从集中式面向单机单用户的主机GIS、桌面GIS发展到基于C/S和B/S应用模式的分布式GIS,在互联网上提供地理信息,实现地理信息资源的共享。空间数据需要被广泛共享、交换与使用,空间数据存储与处理环境从传统集中式向分布式发
类分子银团簇([Agm]n+,可视为n个Ag+与(m-n)个Ag0聚合而成)尺度与电子费米波长相当(亚纳米),介于银原子(Ag0)或银离子(Ag+)与银纳米颗粒(AgNPs)之间,由于尺寸效应,其能级结构不连续。[Agm]n+具有光效高、发光波段可调和光化学稳定性好等显著优点,在光谱转换、生物传感、能源和催化等领域均有重要应用前景。然而,如何使银团簇尺度稳定并均匀分散,一直是研究者所面临的一大难题
本文利用Galerkin方法、Sobolev空间理论、整体吸引子和一致吸引子等理论,研究了四类复杂弹性梁方程(组)系统的初边值问题以及这些系统的长时间整体动力行为最本质的概念吸引子的存在性。首先,利用Galerkin方法结合一些先验估计和不等式技巧和Sobolev空间理论等给出了四类不同系统的整体解的存在性唯一性,从而定义了三类不同的自治无穷维动力系统的半群和一类非自治无穷维动力系统的双参数过程族
社会实践是高校践行"立德树人"目标的重要载体。近年来,党和国家高度重视实践育人工作,习近平总书记多次在会议中强调实践出真知,"要坚持知行合一,注重在实践中学真知、悟真谛,加强磨炼、增长本领"。高校应做好大学生暑期"三下乡"社会实践活动,不断完善实践育人顶层设计,丰富社会实践活动的内涵和形式,扩大社会实践活动的影响力,凸显实践育人的成效,引导和帮助大学生在社会这个大课堂中受教育、长才干、作贡献。