黑胸大蠊浓核病毒（Periplaneta fuliginosa densovirus, PfDNV）的非结构蛋白NS1是一个定位于细胞核中的多功能蛋白,对病毒DNA的复制很重要,具有ATP酶、位点特异性的DNA结合、解旋酶、转录激活等活性,以及细胞致病性。本论文研究了PfDNV NS1的内切核酸酶活性及磷酸化。最开始的时候,我们利用大肠杆菌表达并纯化了带MBP标签的NS1蛋白,没有发现内切核酸酶活性,于是我们改用了Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,在Sf9细胞中表达并纯化了N端融合了MBP的NS1蛋白,展现出了显著的内切核酸酶活性,并确定了切割位点,这种活性需要ATP和金属离子的辅助,缺一不可,同时,Mg2+的辅助作用强于Mn2+。NS1蛋白行使内切核酸酶功能时,与切割位点处5’端的胸腺嘧啶发生共价结合,根据相关文献推测,NS1的某个酪氨酸残基参与了这种共价结合过程。由于大肠杆菌表达纯化的NS1蛋白没有内切核酸酶活性,而Sf9细胞表达纯化的NS1蛋白却有活性,这使我们想到也许是翻译后的修饰造成了这种差异,特别是磷酸化修饰。于是,我们将Sf9细胞中表达纯化的NS1蛋白分别用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）、T细胞酪氨酸磷酸酶（TC PTP）和Lambda蛋白磷酸酶（Lambda PP）三种去磷酸化酶进行去磷酸化反应,纯化之后与未去磷酸化的NS1进行活性比较。经CIP和TC PTP处理的NS1蛋白失去了内切核酸酶活性,而经Lambda PP处理的NS1蛋白仍保有部分活性。这说明酪氨酸残基的磷酸化对NS1蛋白的内切核酸酶活性是很重要的。我们通过酪氨酸磷酸化特异性抗体的免疫印迹实验证实,Sf9细胞中表达纯化的NS1蛋白确实存在酪氨酸磷酸化,而大肠杆菌中表达纯化的NS1蛋白却没有。Genistein是一种广谱的酪氨酸激酶抑制剂,我们发现将表达NS1蛋白的Sf9细胞用不同浓度的genistein进行处理,获得的NS1蛋白的内切核酸酶活性表现出了不同程度的损失,这与去磷酸化实验的结果是一致的。为了识别NS1蛋白中被磷酸化的酪氨酸以及内切核酸酶的活性核心酪氨酸,我们利用重叠延伸PCR的方法构建了一系列突变,将NS1蛋白序列中保守性很强的酪氨酸残基突变成了苯丙氨酸残基,并在杆状病毒表达系统中表达纯化,在体外检测了这些突变型NS1蛋白的内切核酸酶、DNA特异性结合、解旋酶及ATP酶的活性,发现突变型Y86F、Y178F和Y345F的内切核酸酶活性均有异常,有可能是酪氨酸磷酸化的位点。其中,第86位酪氨酸与内切核酸酶切割位点的特异性有关；第178位酪氨酸是NS1蛋白内切核酸酶酶活性的核心酪氨酸：突变型Y345F失去内切核酸酶活性的同时,ATP酶和解旋酶的活性也完全丧失了。我们将真核表达纯化的NS1蛋白进行串联质谱分析,发现在NS1蛋白的第345位酪氨酸残基上发生了磷酸化,而第86位和第178位的酪氨酸并没有检测到磷酸化。第345位酪氨酸残基位于解旋酶保守结构域的附近,该位点的磷酸化可能与NS1解旋酶活性区域的正确折叠有关,突变后将导致解旋酶活性的丧失,从而影响了内切核酸酶活性。细小病毒科其它研究过的NS1蛋白中,一般都是在丝氨酸和苏氨酸残基上进行磷酸化的修饰,酪氨酸残基并不被磷酸化,而黑胸大蠊浓核病毒的NS1蛋白采用了酪氨酸残基磷酸化的模式来调节内切核酸酶的活性,这很特别,有助于进一步的理解病毒基因组复制调控的机制。