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新城疫(Newcastledisease,ND)是严重危害家禽养殖业的烈性传染病,它的病原是新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)。该病的防控主要依靠接种疫苗,耐热的弱毒活疫苗便于贮存运输,对热带地区和偏远的乡村地区有重要应用价值。国外选育的耐热型V4、1-2等疫苗毒株已经在东南亚、非洲等热带地区的广大乡村使用,并且产生了很好的预防控制效果。我国虽然引进了 V4等耐热株,也通过进一步耐热筛选培育了适合我国使用的耐热弱毒株,但限于知识产权等因素,至今未在我国得到推广应用。本实验室早期分离到一株NDV耐热强毒HR09株,前期已鉴定了其生物学特性,建立了反向遗传学操作平台,但关于其耐热性的分子基础研究尚不全面。本研究在前期研究的基础上,通过耐热传代试验,测定不同代次毒株囊膜蛋白基因(F、HN基因)核苷酸序列,研究病毒在热压迫下其遗传变异规律;利用生物信息学分析方法,在核酸和氨基酸水平上研究NDV耐热性相关基因的特征,初步探明病毒囊膜蛋白耐热的分子基础。同时,以HR09株为骨架,将HR09株F蛋白基因替换为LaSota株F蛋白基因,构建嵌合病毒,进一步研究F蛋白对病毒耐热性的影响,并期望获得1株耐热的NDV弱毒株,为创制我国自主的NDV耐热弱毒疫苗打下基础。1.HR09株囊膜蛋白基因遗传变异规律与序列比较对本实验室保存的耐热强毒株HR09在56℃热浴的环境下进行耐热传代,共传30代(前5代测定了该毒株的耐热极限,后25代对病毒进行105min耐热处理),分别对耐热处理的5代、20代和30代的F、HN基因进行扩增、序列测定及分析,研究病毒在热处理环境下F和HN基因的遗传变异情况。结果显示该毒株耐热极限为56℃ 120min,病毒第5、20和30代的F和HN基因均产生了一些同义和非同义的突变,以第30代毒株产生的突变为多,其中F基因上在第30代产生的同义突变有2个(A1071T、T1320C),非同义突变位点有3个(G311A、A1295T、A1476T),相应的F蛋白上氨基酸突变位点为G104E、K432I、K492N;HN基因第30代产生的核酸位点同义突变有3个(T748C、T1116C、G1122A),非同义突变有2个(T755C、C1368G),相应的HN蛋白氨基酸突变位点为F252S、H456Q。利用SMS在线序列分析工具(http://www.bio-soft.net/sms)、Megalign 和 MEGA7分析软件,将耐热HR09株第30代F、HN基因序列、HR09原代毒株F、HN基因序列和目前已知的5个耐热株(V4、1-2、NDV4-C、TS09-C、AF2240)及不耐热株LaSota的F和HN基因序列进行比较,结果显示,在核苷酸水平上,耐热株F基因的GC含量均比不耐热株LaSota要高(45.15%/44.46%);除AF2240和HR09两株基因Ⅷ型的耐热强毒株外,耐热株HN基因的GC含量也比不耐热株LaSota要高。经耐热处理传30代的HR09株HN基因的GC含量高于原代毒株(45.69%/45.57%);同源性分析显示,耐热HR09 30代株与原代毒株F、HN基因的同源性均为99.7%;在所有已经发现的耐热毒株中,HR09株与不耐热LaSota株的差异最大;F和HN基因系统进化分析显示,已经发现的耐热株分布在基因Ⅰ型和基因Ⅷ型。在氨基酸水平上,耐热HR09株与不耐热株的F蛋白同源性差异最大(10.90%),在氨基酸组成上,F蛋白的脯氨酸含量以不耐热株高,而HN蛋白的脯氨酸含量以耐热株的高(5.23%/5.00%);耐热毒株HN蛋白中酸性、疏水性氨基酸的含量普遍偏高(酸性氨基酸:7.00%/6.70%,疏水性氨基酸:40.89%/39.00%)。2.F、HN蛋白结构模拟与分析利用 PDB 结构自动模拟软件(https://www.predictprotein.org/和 https://swiss-model.expasy.org/),对HR09原代、HR09耐热处理第30代株、V4株和LaSota的F、HN蛋白分别进行二、三级结构模拟与比较分析。利用VMD、Discovery Studio 2.5等软件进行结构显示与分析。结构模拟结果显示,F、HN蛋白整体结构与同源蛋白模板一致,但存在一些内部结构差异。二级结构预测结果显示,在数量上,F蛋白中螺旋结构和折叠结构与耐热性无关、无规则卷曲含量越低,NDV的耐热性越强;在HN蛋白中螺旋结构也与耐热性无关、折叠结构含量越低、无规则卷曲含量越高,NDV的耐热性越强。就二级结构所处的位置而言,F蛋白34-38aa的螺旋结构,408aa、448-450aa位置的折叠结构,56-57aa、244-245aa之间的无规则卷曲,与NDV耐热性有关;HN蛋白中,605-611aa之间多存在一个长度为6aa的螺旋结构、562-565aa之间的折叠结构、421-423aa的无规则卷曲,与耐热性有关。三级结构预测结果显示,F蛋白中,94-130aa之间的二级结构的数量可能影响病毒耐热性能,而在蛋白尾部466aa之后二级结构的数量可能与耐热性能有关;HN蛋白中,149-173aa连接桥缺失,无规则卷曲区域扩大、293aa和533-545aa之间转角结构转变为螺旋结构和473aa附近α-螺旋的增加,均能提高NDV耐热性。结合HR09 30代株F、HN蛋白氨基酸突变情况和HR09株、HR09 30代株结构预测结果,显示,F蛋白中位于第二疏水区(融合诱导区)附近的G104E,在HR09株中位于无规则卷曲中,而在HR09 30代株中位于螺旋中;位于HB-B(七肽重复区B)附近的K4321和位于第三疏水区(蛋白跨膜区)附近的K492N在HR09株、HR09 30代株中所处二级结构没有改变。HN蛋白中F252S、H456Q均处于胞外区,完全保守的半胱氨酸残基附近,且所处二级结构没有改变。3.rHR09-LaSota-F嵌合病毒基因组全长克隆的构建利用本实验室构建的HR09株反向遗传平台,首先以Overlap RCR的方法,将LaSota株F基因与HR09株R2质粒(4157-6898nt)中F基因进行替换,构建rR2-LaSota-F质粒。然后,利用BsmB Ⅰ和Spe Ⅰ双酶切、Overlap RCR等方法,将rR2-LaSota-F质粒与R1、R3质粒进行拼接,构建rT123-LaSota-F质粒(2249-9535nt)。其次,利用Spe Ⅰ和FspA Ⅰ双酶切,将rT123-LaSota-F质粒与TL2质粒进行拼接,构建rTM-LaSota-F质粒(2296nt～13048nt)。最后,利用Apa Ⅰ和Mlu Ⅰ双酶切,将质粒rTM-LaSota-F与TVT-V进行拼接,通过PCR扩增鉴定后,确定拼接结果为rHR09-LaSota-F嵌合病毒基因组全长。本实验构建完成了 rHR09-LaSota-F嵌合病毒的基因组全长质粒。