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脓毒症的定义为感染引发的宿主免疫系统失调导致的器官功能障碍,致死率高;脓毒性休克为脓毒症伴随严重的循环系统和细胞代谢功能障碍。脓毒症以高发病率和致命性受到广泛关注,根据最近的数据,美国的脓毒症病例数从1996年的387330l例上升到2011年的110万,预计2020年将达到200万,脓毒症导致的死亡率接近心脏病发作的死亡率,超过了中风死亡率;所以早期的干预治疗是非常必要的。尽管脓毒症治疗策略经过近二十多年的发展,液体复苏、抗生素治疗以及血液透析等技术已取得了巨大的进步,脓毒症预后改善仍不明显。中性粒细胞是数量最多的参与固有免疫应答的细胞。脓毒症早期即宿主受到病原体攻击时,骨髓内的中性粒细胞迅速动员,大量中性粒细胞在趋化因子的作用下迁移至病灶部位通过吞噬、脱颗粒作用以及形成胞外诱捕网发挥清除病原体作用。虽然中性粒细胞对病原体清除非常重要,但研究已证实中性粒细胞与器官功能损伤密切相关。脓毒症过程中中性粒细胞的凋亡延迟以及其激活后释放的大量炎症因子引发的级联反应可导致组织缺氧和器官功能障碍。程序性死亡蛋白-配体1(programmed cell death protein-ligand 1,PD-L1)是免疫激活的标志,其与程序性死亡受体-1的相互作用可抑制抗原特异性免疫反应,导致T淋巴细胞功能障碍、活化的免疫细胞耗竭及免疫耐受。肿瘤或炎症环境可诱导PD-L1在抗原递呈细胞、肿瘤细胞上表达。有研究证实脓毒症时PD-L1也可表达于中性粒细胞上,并且PD-L1阳性的中性粒细胞可诱导淋巴细胞凋亡;同时有研究表明PD-L1与B7-1分子互为配体,可发挥抑制淋巴细胞增殖的作用。那么PD-L1作为传统的配体,是否可发挥类似于受体的胞内信号激活作用?此外利用丹麦科技大学(DTU)的NetPhos2.0 Server程序做磷酸化位点分析发现PD-L1的蛋白序列分析具有类似YXXM结构域,而YXXM序列可与PI3K结合并活化p85亚基,PI3K/Akt信号通路在调控细胞凋亡中发挥着重要作用。那么PD-L1是否参与脓毒症时中性粒细胞凋亡延迟的调控?由此在本课题中着重探讨脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达与PI3K/Akt信号通路及自身凋亡的相关性。第一部分脓毒症时PD-L1调控中性粒细胞凋亡的作用【目的】探索脓毒症时中性粒细胞上PD-L1的表达水平与其凋亡的关系。【方法】1、分离纯化健康志愿者静脉血的中性粒细胞,并将其分为3组:对照组(Con)、IFN-γ刺激组、IFN-γ+LPS共刺激组,刺激21小时后免疫印迹法检测PD-L1的表达水平以及流式细胞仪检测中性粒细胞的凋亡率。人急性早幼粒白血病细胞系(HL-60)具有诱导分化成类中性粒细胞的特性并且其表达PD-L1,将其分为对照组(Control)和维甲酸刺激组(RA组)进行刺激,21小时后流式检测免疫印迹法检测PD-L1的表达水平以及流式检测HL-60细胞的凋亡率。2、分离纯化脓毒症患者的中性粒细胞,流式技术检测培养24h后的凋亡率,同时收集细胞用免疫印迹法检测PD-L1的表达。3、siRNA干扰脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达,21h后免疫印迹法检测siRNA的转染效率以及流式检测其凋亡率;利用IFN-γ和LPS刺激健康志愿者中性粒细胞PD-L1的表达,并利用siRNA干扰PD-L1的表达,21h后免疫蛋白印迹法检测PD-L1以及流式检测中性粒细胞的凋亡率。【结果】1.共采集6例健康志愿者的中性粒细胞,经IFN-γ和IFN-γ+LPS刺激后,中性粒细胞PD-L1表达上调,且培养21小时后凋亡率明显降低(P<0.01);RA刺激HL-60细胞系分化成中性粒细胞,与对照组相比,RA刺激组PD-L1表达下调,且其凋亡率明显增加(P<0.01);2.共收集了14例脓毒症患者中性粒细胞,培养24小时后的其凋亡率与PD-L1的表达水平呈负性线性关系(R2=0.4417,P=0.01)。3.siRNA转染脓毒症中性粒细胞,其凋亡率明显升高(P<0.01);PD-L1 siRNA转染IFNγ+LPS刺激后的正常中性粒细胞的凋亡率与单纯IFNγ+LPS处理组相比,其凋亡率明显升高(P<0.01)。【结论】PD-L1在中性粒细胞上的表达增加,而中性粒细胞的凋亡率下降,说明脓毒症时中性粒细胞PD-L1参与自身凋亡作用的调控。第二部分PD-L1调控中性粒细胞凋亡作用的机制【目的】探讨脓毒症时PD-L1调控中性粒细胞凋亡的可能机制【方法】1.腺癌人肺泡基底上皮细胞细胞系(A549)具有易转染特性,常作为转染宿主;PD-L1全长质粒(PD-L1FL/GFP)转染A549细胞系,免疫荧光法检测已转染的A549细胞系内PD-L1的GFP荧光与p85亚基的FITC荧光的结合情况。2.人胚肾细胞系293(HEK293)极少表达细胞外配体所需的内生受体,且易转染;利用PD-L1全长序列(PD-L1FL/GFP)和胞内段敲除(PD-L1TD/GFP)质粒转染HEK293细胞,免疫共沉淀检测PD-L1与p85的存在相互作用。3.利用siRNA干扰HL-60细胞系PD-L1的表达,21小时后免疫印迹法检测p AKT和AKT的蛋白水平。4.利用siRNA干扰分离纯化的脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达,21小时后免疫印迹法检测p AKT和AKT蛋白水平。【结果】1.携带GFP的PD-L1全长质粒和胞内段敲除质粒构建成功。免疫荧光双染法发现PD-L1的GFP荧光与p85亚基的FITC荧光可重合。2.PD-L1FL/GFP和PD-L1TD/GFP转染HEK294细胞系行免疫共沉淀后发现PD-L1可与P85相互作用,且与PD-L1胞内段无关。3.PD-L1 siRNA转染HL-60细胞后,其p AKT水平降低。4.PD-L1 siRNA干扰脓毒症患者中性粒细胞后,其p AK水平下调【结论】脓毒症时PD-L1可调控中性粒细胞的凋亡作用,其调控机制可能与PI3K/AKT信号通路相关。