急性肝衰（ALF）的治疗是当代临床医学的一大难题，常规治疗病死率高达80％。虽然肝移植（LT）可将ALF的病死率降低到30-50％，但是，LT存在急诊手术时供体来源困难、手术复杂、患者需要终生接受免疫抑制治疗及费用昂贵等缺点。作为肝脏替代疗法的另一个方向，人工肝的研究在近40年来取得了长足的进展。目前，国外以培养的肝细胞与人工辅助装置相结合的生物人工肝（BAL）所进行的动物实验及临床初步应用结果已表明，BAL不仅可能代偿ALF患者肝脏解毒、生物合成功能及稳定内环境、阻断恶性循环，而且为具有强大再生能力的肝细胞提供了再生的条件和时间。经过逐渐成熟和完善后，BAL可望将不会仅停留为等待LT的一种过渡治疗手段，而极有可能象肾透析曾给肾功能衰竭的治疗带来革命性变化一样，为ALF的现代治疗提供最大的希望。结合本课题的前期工作，本研究用微载体粘附悬浮培养的原代正常猪肝细胞作为生物材料构建BAL，进行治疗猪ALF的实验，旨在为BAL早期进入临床Ⅰ期试验提供依据。 第一部分：猪肝细胞的分离与微载体粘附悬浮培养 目的 获得一个具有丰富来源的肝细胞生产技术。 方法 取本地杂种小猪作为肝细胞供体。用Seglen改良二步胶原酶原位循环灌注法分离获取肝细胞悬液，台盼蓝（TB）染色法计算细胞数及细胞活率。将Cytodex-3微载体按5mg/mL的浓度加入经5％甲基硅树脂乙酸乙酯溶液硅化的STUART搅拌培养瓶中。猪肝细胞按5×10~6/mL的密度全部接种于培养瓶，随后加入培养液及附加因子至1/3最终体积，搅拌培养6小时后加入培养液及附加因子至最终体积200mL，然后持续搅拌培养。光镜及电镜下观察细胞生长情况，动态检测培养上清中白蛋白及尿素浓度。 结果 每只猪肝平均获取肝细胞数为N．26土 0．75）XIO‘＼活率为o91．22士0．83）％。猪肝细胞在接种后即呈明显的Cytodex刁聚集趋势，在培养48－72小时后可见典型的多细胞聚球形成，该形态特点及白蛋白、尿素合成能力可保持约4周左右。 结论 采用IV型胶原酶原位门腔循环灌注可分离获取大量。高活性的原代正常猪肝细胞，经微载体粘附悬浮培养后可达到高密度。高活性、长期离体培养的目的，可满足BAL对生物材料的要求。