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目的:研究携带miR-184的重组腺病毒(ADV-miR-184)体外转染对人晶状体上皮细胞增殖、凋亡、移行及黏附的影响。
方法:构建ADV-miR-184,在293细胞中扩增、纯化并滴定病毒的滴度,测定不同病毒复合感染度(MOI)下的转染效率。ADV-miR-184体外转染人晶状体上皮细胞(HLE-B3),观察ADV-miR-184对HLE-B3生长状态的影响;采用台盼蓝(Trypan Blue)拒染法、噻唑蓝(MTT)比色法观察对HLE-B3增殖的影响;通过TUNEL法检测ADV-miR-184对细胞凋亡的影响:通过细胞划痕实验测定ADV-miR-184对HLE-B3移行距离的影响;应用Western Blot检测整合素β1,粘着斑激酶(FAK)以及磷酸化的粘着斑激酶(p-FAK)在HLE-B3中的表达情况。
结果:成功构建重组腺病毒ADV-miR-184,并将重组腺病毒扩增纯化后测定病毒滴度为1.6×109puf/ml,MOI100,MOI200,MOI500下转染效率均可达到70%。细胞形态学观察发现ADV-miR-184转染的HLE-B3由贴壁生长的梭形、多角形变为圆形,逐渐脱壁,悬浮于培养液中;ADV-miR-184转染HLE-B3后的0~96h细胞增殖速度明显减慢,与相应对照组比较,差异均有统计学意义(p<0.05);48h观察细胞发现细胞出现凋亡和坏死;细胞移行试验发现,以不同浓度ADV-miR-184作用于HLE-B372h后,其移行距离随着ADV-miR-184的浓度而变化,MOI100组与MOI50组、MOI10组相比较有明显差异(p<0.05)。而在MOI100、MOI200、MOI500实验组中,发现HLE-B3的移行距离随着浓度增加而变化不明显。在MOI100感染条件下,观察不同时间点(0-96h)细胞移行距离,发现与正常细胞对比,感染细胞的移行距离在每个时间点都明显降低(p<0.05)。ADV-miR-184感染后48h、72h,整合素β1表达水平和对照组比较分别降低了40.1%、53.4%,磷酸化FAK的表达水平和对照组比较分别降低了35.4%,66.7%。
结论:ADV-miR-184具有减慢HLE-B3的增殖速率、减缓HLE-B3移行及减弱HLE-B3粘附的作用。并推断整合素β1及其相关的蛋白激酶通路在此过程中起重要作用