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本文提出了在对纳米制剂(Nanoparticle,NP)进行药代动力学评价时,应以体内释放的游离药物作为药动学评价的基础,以游离药物作为纳米制剂的药效学、药代动力学和药理毒理学的纽带。通过全面了解纳米制剂在体内释放出的游离药物的分布、代谢和排泄,得到具有“生物活性(Bioavailable)”的药动学结果,进而能够为准确推测NP的药效与毒性提供依据,为NP的研发、临床药代研究和临床应用提供支持。本文选择了国内已上市的多美素(?)为模型药物,对PEG化盐酸多柔比星脂质体注射液(Doxorubicin hydrochloride PEGlyted liposome injection,DOX·HC1-PLI)在大鼠和荷瘤鼠体内的药动学进行了系统研究,并对DOX·HC1-PLI对人CYP450酶的影响进行了研究。本文验证了纳米药动学理论的可行性,为DOX·HC1-PLI纳米药动学研究提供了大量的数据支持,为今后的纳米制剂的评价提供了一种可借鉴的思路。(1)盐酸多柔比星脂质体的大鼠血浆药物动力学研究建立能够分离血浆中释放出的游离药物的固相萃取预处理方法,并开发出能够同时测定大鼠血浆中DOX及五种代谢物的LC-MS/MS分析方法,对DOX·HC1-PLI在大鼠血浆中的纳米药动学进行了研究。结果表明:在血浆中,DOX主要以负载药物的形式存在并缓慢释放游离药物,血浆中95%以上均为负载药物,血浆中的游离药物能够迅速的向全身组织分布;相比于普通制剂,DOX·HC1-PLI使血浆中游离药物的峰浓度降低了 4倍,零时血药浓度降低了 10倍;DOX·HC1-PLI能够提高药物的利用度,相比于普通制剂,血浆中游离药物的药时曲线下面积(area under the concentration-time curve,AUC)增大了 9.6 倍,总药物的 AUC 增大了 783 倍;DOX·HC1-PLI改变了药物在全身的分布情况,普通制剂给药,DOX(指普通制剂给药后体内的药物)的表观分布容积为72632 mL/kg,DOX·HC1-PLI给药后,R-DOX(指纳米制剂给药后体内的释放药物)的表观分布容积为5376 mL/kg,T-DOX(指纳米制剂给药后体内的总药物)的表观分布容积为201mL/kg。DOX·HC1-PLI改变了药物在体内的代谢速率,给药后在血浆中几乎难以检测出DOX的代谢产物。结果说明DOX·HC1-PLI实现了化疗药物在体内的长循环,并显著降低血浆中释放的游离药物峰浓度,减轻药物的全身毒副作用。(2)盐酸多柔比星脂质体的大鼠组织分布研究研究首次建立分离大鼠组织中E-DOX(指纳米制剂给药后体内的负载药物)的预处理方法,并对首次对DOX·HCl-PLI组织水平的药物释放与E-DOX的分布进行了研究。DOX·HC1-PLI具有免疫系统靶向性,在脾脏内R-DOX的峰浓度升高了 1.5倍,T-DOX的峰浓度升高了 2.1倍;多柔比星的心脏毒性与其在心脏内的峰浓度是呈高度相关的,普通制剂给药后,大鼠心脏内药物的峰浓度是R-DOX的2.8倍。DOX·HC1-PLI在组织内存在着R-DOX的释放与消除的动态平衡过程,且该动态平衡过程能够维持较长时间;组织内药物的释放与消除达到动态平衡后,R-DOX占总药物的比例为70%-80%,肺脏内制剂释放药物的比例较低,R-DOX约占60%;DOX·HC1-PLI使药物在体内生成代谢产物的时间发生了延后,且代谢产物的浓度也有所降低。在正常大鼠组织内,代谢产物以多柔比星醇(doxorubicinol,M1)为主,多柔比星酮(doxorubicinone,M2)、7-脱氧多柔比星苷元(7-deoxydoxorubicin aglycone,M4)和 7-脱氧多柔比星醇苷元(7-deoxydoxorubicinol aglycone,M5)在组织内的含量较低,多柔比星醇酮(doxorubicinolone,M3)仅有微量的分布。(3)盐酸多柔比星脂质体在荷瘤鼠的组织分布研究DOX·HC1-PLI使药物在肿瘤组织内的分布得到提高,与普通制剂相比,游离药物在肿瘤内的峰浓度提高约26%,总药物浓度提高约58%;DOX·HC1-PLI能够减少药物在心脏内的分布,普通制剂给药后,心脏内DOX的峰浓度是R-DOX的40倍,是T-DOX的17倍,说明DOX·HC1-PLI有效降低心脏毒性;DOX·HC1-PLI给药后12 h,在肿瘤、肝脏、脾脏和肺脏中R-DOX的释放与消除基本达到动态平衡,此时R-DOX占总药物的比例在60%-80%之间,肿瘤内R-DOX的占比最高,在36h时,肿瘤内有86%的药物以游离药物形式存在。DOX代谢物的组织分布结果表明,在荷瘤鼠组织内M1的含量较高,M2、M4和M5的含量较低,M3在荷瘤鼠体内未能检测到分布。(4)盐酸多柔比星脂质体的排泄研究首次建立同时测定大鼠胆汁和尿液中DOX及五种代谢产物的LC-MS/MS分析方法,并对DOX·HC1-PLI给药后胆汁和肾排泄与普通制剂的异同进行了研究:普通制剂给药后96h内,药物经胆汁累积排泄32%(Dose%,其中DOX,27%;M1,4.4%;M3,0.07%;M4,0.02%;M5,0.02%),120 h 内经尿液累积排泄 11.2%(DOX,10.5%;M1,0.48%;M2,0.14%;M4,0.012%;M5,0.007%)。DOX·HC1-PLI 给药后 84 h内,药物经胆汁累积排泄 6.35%(DOX,5.55%;M3,0.002%;M4,0.01%),120h内经尿液累积排泄 3.37%(DOX,3.105%;M1,0.186%;M2,0.075%)。DOX·HC1-PLI能够减少药物的肝脏和肾脏排泄,相比于普通制剂,DOX·HC1-PLI在尿液中的总累积排泄量降低约3.3倍,在胆汁中的总累积排泄量降低约5.0倍。从代谢物的排泄结果来看,M2主要经过尿液排泄,M3主要经过胆汁排泄。(5)盐酸多柔比星脂质体对人CYP450酶影响研究利用质谱的正负离子切换技术,建立同时测定9种探针底物代谢产物的LC-MS/MS分析方法,方法具有较高的分析通量。应用该方法考察了药物对CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP2A6 和 CYP2B6 酶的抑制作用。对DOX·HC1和DOX·HC1-PLI对上述8种CYP450酶的抑制作用进行了研究,结果表明:DOX·HC1对8种CYP450酶均能表现出抑制作用,而DOX·HC1-PLI对8种CYP450酶无抑制作用或抑制作用极弱,说明脂质体纳米制剂具有更好的临床安全性。DOX·HC1-PLI给药后,体内R-DOX、E-DOX和T-DOX三者的药代行为是不同的,只有体内释放出的R-DOX才具有相关的药学活性,仅仅以T-DOX来评价DOX·HC1-PLI的药代动力学是不恰当的。在对NP进行药代评价时,应以体内制剂释放的游离药物作为研究基础,才能得到准确的药代评价。