肌生成抑制素是近几年来发现的骨骼肌生长的负调控因子，其活性的丧失，会引起动物肌肉的过度发育，肌纤维直径变大或肌纤维数增加，表现为动物的“双肌”性状。肌生成抑制素相关研究的突破将对猪、肉鸡、肉牛等畜禽生产性能的提高具有特别重要的意义。 肌生成抑制素在肉用动物上的应用，可从几个方面考虑：筛选肌生成抑制素的抗体或抑制剂，使其与肌生成抑制素结合，灭活其功能；使用能与肌生成抑制素受体结合的物质，拮抗肌生成抑制素的功能；寻找与肌生成抑制素基因紧密连锁的遗传标记，选育肌生成抑制素基因突变，不能正常表达其活性的品种；用突变的基因与正常动物的基因进行同源重组，获得肌生成抑制素基因缺失动物。但是，目前对于猪肌生成抑制素的基础研究如组织定位和如何利用方面还很薄弱，因此，本研究利用免疫组织化学及Western-blot等方法和手段深入研究了猪肌生成抑制素的组织分布，为进一步开展猪肌生成抑制素的受体研究等打下坚实的基础。 实验共分三个部分：猪肌生成抑制素C端88氨基酸基因合成及原核表达研究、猪肌生成抑制素C端88氨基酸肽抗体制备及组织定位研究和猪肌生成抑制素在COS-7细胞中表达及检测研究。 猪肌生成抑制素C端88氨基酸基因合成及原核表达 由于肌生成抑制素C端编码序列为保守序列，具有良好的抗原决定簇，故本研究旨在构建猪肌生成抑制素C端88氨基酸编码序列的克隆与表达载体，并获得其C端88氨基酸的表达产物，从而获得其较好的半抗原，为制备其抗体打下良好的基础。 将猪肌生成抑制素编码序列下游883-1126bp按大肠秆菌嗜好密码子进行优化，将优化后序列双链分成12个单链片段，F₁、F₂、F₃、R₆、R₅、R₄、F₄、F₅、F₆、R₃、R₂、R₁，采用化学合成方法合成，每对相邻互补片段之间有20bp序列交叉重叠。F₁长38bp，R₁长36bp，其他片段均40bp长，F₁和R₁片段两端分别加上限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ的识别位点序列。经RCR扩增出254bp片段，该片段与pMDI8-T载体连接，转化JM109感受态细胞，所得阳性克隆进行测序分析，得到的克隆序列与设计的序列完全一致，表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。从阳性细菌中提取质粒，经NcoⅠ和XhoⅠ酶切，回收 254hp目的片段，定向克隆到pET28a中，转化DH卜受体菌，提取质粒，再转化 到BLZI中，成功筛选出阳性克隆。阳性菌经IPTG诱导，通过SDS－PAGE，检 测出猪肌生成抑制素的表达。 猪肌生成抑制素C端88氨基酸肽抗体制备及组织定位研究 本试验首先利 用试验一所构建的原核表达工程菌…ET＜8a－MSTN毛)，用IPTG诱导工程 菌产生猪肌生成抑制素下游包涵体，应用SDS．PAGE侧带法纯化包涵体蛋白， 并用EDCI进行直接偶联，皮下多点注射实验用獭兔，连续免疫3次，每次间隔 2周，其间用酶联免疫吸附试验（ELISA）跟踪检测抗体效价。6周后，心脏采 血，经ELISA及Western－blot检测，获得高效价的MsTND抗血清，血清滴度达 16400。同时，对长白猪九种新鲜组织、器官利用SP免疫组化染色试剂盒进行 免疫组织化学和 Western蛋白免疫印记研究，研究了 MSTN在猪各个内脏器官的 定位，确定MSTN的组织分布，为进行MSTN的受体研究打下坚实的基础。结 果表明：MSTN在肺脏、肝脏、小脑、胰脏、心脏和脂肪细胞中呈现重度染色， 说明MSTN在这些组织细胞中均有分布：而在肌肉、肾脏、子宫细胞中出现轻 微染色，这说明 MSTN在这些组织细胞中分布较弱（200倍光镜）；Western．bot 检测结果表明：在肺脏、肝脏、小脑、胰脏、心脏和脂肪中MSTN分布较多， 而在肌肉中分布较弱，在肾脏和子宫中未见分布。 猪肌生成抑制素在COS．7细胞中表达及检测研究 本研究旨在构建猪肌生 成抑制素成熟蛋白编码序列的真核表达载体，并在真核细胞中进行表达。从而为 筛选能稳定表达猪MSTN的细胞株，寻找猪肌生成抑制素作用的受体打下良好 的基础。本研究首先设计引物（CCD895lwfl、CCD895lwfZ）扩增出 MSTN WDNA 片段，通过PCR、酶切鉴定及序列分析，成功筛选到阳性克隆。将克隆质粒与 真核表达载体pefdhfrla酶切，回收目的片段及pefdhfrla载体，连接、转化、 酶切鉴定及测序分析后，构建了猪MSTN成熟蛋白编码序列的真核表达质粒 pefdhfrlaMSTh。采用脂质体法转染COS－7细胞，提取转染细胞总RNA，分别 从mRNA和蛋白水平上检测到了MSTN的表达，并用Western七＊ 证实了其表 达的特异性。