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研究背景胶质瘤（Glioma）是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,传统治疗方式的治愈率低,患者预后差。近年来,肿瘤免疫疗法在多种肿瘤的治疗中显示出较好的效果,但对胶质瘤的疗效仍不如人意,这是由于胶质瘤在发生发展过程中形成了复杂的免疫抑制性微环境。髓源性抑制细胞（Myeloid-derivedsuppressorcells,MDSCs）是胶质瘤微环境的重要组成成分,能够通过分泌细胞因子以及表达胞外酶CD73等途径抑制T细胞的功能,增强胶质瘤对免疫治疗的抗性,促进胶质瘤的恶性进展。MDSCs作为来源于骨髓的细胞,其分化过程在外周循环中已经开始,因此胶质瘤必定能通过某些途径远距离调控MDSCs的分化,促进胶质瘤免疫抑制性微环境的形成。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）也是胶质瘤微环境的重要成分,能够调控肿瘤免疫,促进肿瘤的恶性进展。骨髓来源的MSCs（Bone marrow-derived MSCs,BM-MSCs）本身具有一定的免疫调节作用,能够抑制树突状细胞成熟、促进巨噬细胞M2极化等,但胶质瘤微环境中的胶质瘤相关MSCs（Glioma-associated MSCs,GA-MSCs）对MDSCs的调控作用以及GA-MSCs的形成机制尚不清楚。外泌体（Exosomes）是由细胞分泌的、在脑脊液以及血液等多种体液中广泛存在的、直径约50-150nm的囊泡。胶质瘤细胞可以通过分泌外泌体,将核酸及蛋白质等物质传递给受体细胞,如MDSCs以及MSCs等,对其进行改造以促进免疫抑制性微环境的形成。本文以探究胶质瘤免疫抑制性微环境的形成机制为目的,发现胶质瘤外泌体一方面可以直接诱导MDSCs的分化与活化,另一方面还可以改造MSCs,通过MSCs间接增强MDSCs的免疫抑制能力,共同促进MDSCs相关免疫抑制性肿瘤微环境的形成以及胶质瘤的恶性进展。第一部分胶质瘤外泌体直接促进MDSCs相关免疫抑制性肿瘤微环境形成的机制研究目的探究胶质瘤患者脑脊液、血浆以及胶质瘤细胞上清中分离的外泌体对MDSCs的调控作用及机制,寻找新的免疫治疗靶点。方法1、使用胶质瘤患者脑脊液、血浆以及胶质瘤细胞上清中分离的外泌体处理人外周血单个核细胞,流式细胞术检测MDSCs的比例及其对T细胞的抑制能力。2、对胶质瘤患者脑脊液以及常氧、低氧胶质瘤细胞上清中分离的外泌体进行miRNA测序,并将高表达的miRNA在单核细胞中过表达,筛选出能够促进MDSCs分化和活化的miRNA。3、利用转录因子预测数据库TransmiR筛选出关键miRNA的转录因子,并通过染色质免疫沉淀等实验进行验证。4、利用miRNA的pull-down质谱测序数据筛选出关键miRNA的外泌体分选蛋白。5、寻找能够抑制关键miRNA的药物,小鼠体内实验检测其对胶质瘤的治疗作用。结果1、胶质瘤患者脑脊液、血浆中分离的外泌体能够促进MDSCs的分化并增强其对T细胞的抑制能力;胶质瘤细胞来源的外泌体具有相同的作用,且低氧胶质瘤外泌体的MDSCs诱导作用强于常氧胶质瘤外泌体。2、miR-1246在胶质瘤患者脑脊液分离的外泌体中高表达,且能促进MDSCs的分化和活化。胶质瘤细胞外泌体中miR-1246的含量最高,且低氧能够上调外泌体miR-1246的含量。3、POU5F1是miR-1246的转录因子,且低氧通过HIF-1α通路上调其表达。4、hnRNPA1能够介导miR-1246分选至外泌体中,且低氧通过HIF-1α通路上调其表达。5、二甲氧基雌二醇（2-ME2）能够通过抑制HIF-1α通路抑制胶质瘤细胞外泌体miR-1246 的表达,进而抑制 MDSCs 的分化与活化,抑制胶质瘤的恶性进展。结论1、胶质瘤患者脑脊液和胶质瘤细胞上清中分离的外泌体miR-1246可以促进MDSCs的分化与活化。2、低氧通过上调转录因子POU5F1和外泌体分选蛋白hnRNPA1,促进胶质瘤外泌体miR-1246表达。3、二甲氧基雌二醇2-ME2能够通过减少胶质瘤外泌体miR-1246的表达等途径抑制MDSCs,起到治疗胶质瘤的作用。第二部分胶质瘤外泌体通过改造MSCs促进MDSCs相关免疫抑制性肿瘤微环境形成的机制研究目的探究胶质瘤相关MSCs（GA-MSCs）来源的外泌体对MDSCs的调控作用以及胶质瘤外泌体对GA-MSCs的调控作用。方法1、使用骨髓MSCs（BM-MSCs）和GA-MSCs来源的外泌体处理人外周血单个核细胞,流式细胞术检测MDSCs的比例及其表面CD73的表达。2、对BM-MSCs和GA-MSCs来源的外泌体进行miRNA测序,将GA-MSCs外泌体中表达量前十且上调的miRNA在MDSCs中过表达,筛选出能够促进CD73表达的关键miRNA。3、通过转录组测序筛选出GA-MSCs相比于BM-MSCs上调的基因,并与转录因子预测数据库TransmiR和mirTrans取交集,筛选出导致关键miRNA上调的转录因子。4、通过转录组测序比较BM-MSCs和GA-MSCs的DNA甲基化水平,并使用DNA甲基化抑制剂处理BM-MSCs,检测关键miRNA的表达。5、将胶质瘤外泌体中高表达的miRNA转染进BM-MSCs中,筛选出降低MSCs DNA甲基化水平的分子。结果1、GA-MSCs来源的外泌体能够促进MDSCs的分化并上调其表面CD73的表达,且作用强于BM-MSCs来源的外泌体。2、GA-MSCs通过外泌体传递miR-21,上调MDSCs表面CD73的表达。3、GA-MSCs中高表达的XBP1s是miR-21的转录因子。4、与BM-MSCs相比,GA-MSCs的DNA甲基化水平降低,且DNA甲基化抑制剂能够促进miR-21的表达。5、胶质瘤外泌体可以通过传递miR-21,抑制MSCs的SP1表达,进而抑制DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达,降低DNA甲基化水平。结论1、胶质瘤相关MSCs来源的外泌体miR-21可以上调MDSCs表面CD73的表达,增强MDSCs的免疫抑制能力。2、胶质瘤外泌体传递蛋白质至MSCs,促进miR-21的转录因子XBP1s表达量上调,促进MSCs细胞及外泌体中miR-21含量升高。3、胶质瘤外泌体传递miR-21至MSCs,通过miR-21/SP1/DNMT1正反馈环路促进MSCs细胞及外泌体中miR-21含量升高。