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目的: 肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma,RCC)是一种起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤,新近研究报道,在欧美地区恶性肿瘤发病率中,RCC在男性中发病率排第六,女性中为第十,RCC已成为威胁人类健康的又一高风险性的恶性肿瘤。初期RCC通常无明显症状,且RCC常以转移快,复发性高为特征,约25%的患者在确诊时已发生远处转移。晚期RCC对于放疗、化疗等临床普遍的治疗手段表现出抵抗效应,因此,探讨其有关生物学特征及其发生机制,寻找有效的药物对于RCC治疗,降低患者死亡率尤为重要。 小白菊内酯(Parthenolide,PTL)为天然存在的倍半萜内酯,从草本植物小白菊胚芽中纯化而来,可用于治疗发热、痉挛、眩晕等,另外还具有止痛及抗炎等作用。近年来,PTL已被证明具有调节免疫,抗氧化、抗肿瘤,尤其是杀伤肿瘤干细胞的作用。目前,PTL对肿瘤的抑制作用已在乳腺癌,肺癌和胰腺癌等肿瘤中得到证实。有证据表明,PTL的这些生物学特性归因于其对NF-kB信号通路的抑制,因此,PTL被认为是NF-kB信号通路的天然抑制剂。同时,另有研究表明NF-kB信号通路可与多种信号通路发生相互作用,包括PI3K-Akt信号通路等,PI3K-Akt信号通路与肿瘤细胞的发生发展密切相关,可调控肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、上皮-间质转化等多种生物学特征。 上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)作为哺乳动物胚胎发育的重要生理过程,也对促进恶性肿瘤发生发展起到重要作用。在EMT过程中,原本呈现上皮样表型的细胞失去其细胞极性,表现出间充质样表型细胞的特点,细胞间黏附力减弱,能够在细胞基质自由移动,同时伴有上皮标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)和间质标志物N-钙粘蛋白(N-cadherin)以及波形蛋白(Vimentin)表达水平的显著变化。另外,EMT过程还涉及多种信号通路和转录因子的参与,其中之一是Snail,作为E-cadherin的阻遏物可触发EMT过程,通过与E-cadherin启动子区域的E-box盒结合,下调E-cadherin表达,诱导EMT发生。近年来研究证实PI3K-Akt信号通路在肿瘤细胞的EMT过程中起重要作用,PI3K-Akt信号通路关键分子Akt可调节Snail表达从而调节肿瘤细胞的EMT过程。同时也有报道称Snail是GSK-3β的下游靶标,GSK-3β可调节Snail的核定位影响肿瘤细胞的EMT过程。研究证实,发生EMT的乳腺癌细胞除获得抗凋亡和侵袭能力外,还产生了自我更新能力,表现出干细胞特点,这也为探究肿瘤发生发展的机制及治疗提供新的方向。 越来越多的研究表明识别肿瘤的生物学特征及其发生机制,开发针对性的治疗手段是治疗肿瘤的重要步骤。据报道,PTL可通过抑制NF-kB信号通路抑制肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭、促进凋亡,此外,PTL还可通过PI3K-Akt信号通路调节宫颈癌细胞的凋亡和自噬,PI3K-Akt又可调节EMT的驱动因子Snail,且PI3K-Akt信号通路又可与NF-kB信号通路发生相互作用,因此,PI3K-Akt信号通路可能是PTL的潜在作用通路并极大可能影响肿瘤的EMT过程。当前,PTL是否能够抑制肿瘤细胞的EMT过程以及肿瘤细胞干性的相关研究少见,尤其在RCC中。因此,本研究以人RCC细胞系(786-O和ACHN)为对象,探讨PTL对人RCC细胞EMT过程的影响,同时,验证并探讨PTL对人RCC细胞增殖、RCC细胞干性等生物学特征的影响,并进一步探讨PTL影响人RCC细胞EMT过程可能的作用机制。 方法: CCK-8法检测PTL对RCC细胞(786-O和ACHN)生存活力的影响,同时根据IC50值设置实验分组:对照组(PTL未处理组)、低浓度实验组(4μm/L PTL处理组)、高浓度实验组(8μm/L PTL处理组)。应用划痕实验及Transwell小室实验检测PTL对两种RCC细胞迁移、侵袭能力的影响,并在蛋白水平上通过Western Blot实验观察基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达变化。应用TUNEL法检测PTL对两种RCC细胞凋亡的影响,并在蛋白水平上通过Western Blot实验观察凋亡相关蛋白BAX、Bcl2及Caspase3的表达变化。应用免疫荧光实验检测PTL对两种RCC细胞EMT过程的抑制作用,同样,通过Western Blot实验检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及EMT驱动因子Snail的表达变化,并在基因水平通过实时荧光定量PCR对个别指标mRNA表达情况进一步验证。应用干细胞微成球实验检测PTL对两种RCC细胞干性的影响,也在蛋白水平通过Western Blot实验观察干性标志物ALDH1、CD133、Sox2及Oct4的表达变化,最终,我们探讨PTL对RCC上皮-间质转化的可能作用机制,通过Western Blot实验观察PI3K-Akt信号通路关键分子PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt的表达变化。 结果: PTL处理两种RCC细胞,一定时间后,CCK-8实验结果显示,PTL可抑制RCC细胞增殖,且随着药物浓度增加,抑制效率增加。集落形成实验直观上验证显示,实验组较对照组集落形成数量减少,说明PTL可剂量依赖性抑制RCC细胞增殖。划痕实验结果显示,划痕愈合比例实验组较对照组明显减少,同时Transwell小室实验中,实验组细胞穿膜数量较对照组减少,Western Blot实验检测到转移相关蛋白基质金属蛋白酶MMP2、MMP9实验组较对照组表达水平降低,说明PTL可剂量依赖性抑制RCC细胞迁移与侵袭。TUNEL实验显示,实验组较对照组,荧光亮染细胞增多,即被标记的DNA断裂的细胞多,DAPI染色后,细胞核具有变形现象,Western Blot实验检测凋亡相关蛋白,实验组较对照组BAX、Cleaved caspase3表达水平升高,Bcl2表达水平降低,说明PTL可促进RCC细胞凋亡。免疫荧光实验显示,实验组较对照组EMT相关蛋白E-cadherin表达水平升高,可见荧光亮染点增加,N-cadherin、Vimentin及转录因子Snail表达水平表达降低,可见荧光亮染点减少,Western Blot实验中,发现实验组较对照组,EMT相关蛋白E-cadherin表达水平升高,N-cadherin、波形蛋白Vimentin及转录因子Snail表达水平表达降低。实时荧光定量PCR结果显示实验组较对照组,E-cadherin的mRNA表达水平升高,Snail的mRNA表达水平降低,说明PTL可抑制RCC细胞EMT过程。干细胞微成球实验结果显示,实验组较对照组干细胞成球能力弱,球体状态差,高浓度组抑制更明显,细胞膜呈破裂溶解趋势。Western Blot实验同时检测到干性相关标志物:ALDH1、Sox2、Oct4及RCC特异性干性标志物CD133实验组较对照组均低表达,说明PTL可抑制RCC细胞干性。此外,研究中Western Blot实验观察到PI3-Akt信号通路关键分子PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt实验组与对照组相比表达水平均降低。 结论: 1.PTL可抑制RCC细胞增殖。 2.PTL可抑制RCC细胞迁移、侵袭。 3.PTL可促进RCC细胞凋亡。 4.PTL可抑制RCC细胞EMT过程。 5.PTL可抑制RCC细胞干性。 6.PTL可能通过PI3K-Akt信号通路抑制RCC细胞的EMT过程。