【摘 要】
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黑枣是由红枣在一定温度、湿度条件下发酵而成的产品,黑褐色,味甘,口感软糯,香气浓郁。多糖是由醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的天然聚合物。红枣多糖是红枣营养物质的重要组成成分,红枣经过发酵,其口感、活性成分等发生变化,多糖含量升高,抗氧化活性增强。目前对于红枣多糖已有较多研究,但有关黑枣多糖的结构及抗氧化活性研究还未见报道,明确黑枣多糖的结构对研究其构效关系,揭示红枣黑化机理及品质调控都有重要意义。
【基金项目】
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山东省重点研发计划项目“红枣微发酵工艺关键技术研究与产品开发”（2016GNC113015）； 山东省2017年度农业重大应用技术创新项目“高附加值固态发酵黑枣深加工关键技术集成与产业化”； 2019年度山东省重点研发计划（公益类专项）“黑变红枣枣醋发酵关键技术与黑枣醋蛋液开发”（2019GNC106061）；
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黑枣是由红枣在一定温度、湿度条件下发酵而成的产品,黑褐色,味甘,口感软糯,香气浓郁。多糖是由醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的天然聚合物。红枣多糖是红枣营养物质的重要组成成分,红枣经过发酵,其口感、活性成分等发生变化,多糖含量升高,抗氧化活性增强。目前对于红枣多糖已有较多研究,但有关黑枣多糖的结构及抗氧化活性研究还未见报道,明确黑枣多糖的结构对研究其构效关系,揭示红枣黑化机理及品质调控都有重要意义。本课题从黑枣中提取分离纯化黑枣多糖,并对纯化后的多糖进行结构表征。此外,通过化学水平和细胞水平抗氧化实验分析了不同黑枣多糖组分的抗氧化活性。主要研究内容及结果如下:（1）黑枣多糖提取分离纯化通过水浴醇沉法、乙酸乙酯脱除脂溶性物质、Sevage法脱蛋白后,得到黑枣粗多糖（BJP）。用DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-100柱层析对BJP进行分离纯化,得到一个中性多糖（BJP-0）和四个酸性多糖（BJP-1、BJP-2、BJP-3、BJP-4）,它们的回收率依次为:2.45%、1.13%、5.56%、13.35%、4.41%。（2）黑枣多糖结构鉴定经紫外光谱检测,纯化后五个组分在260、280 nm处没有明显的吸收峰,表明五种多糖中含有核酸和蛋白质较少。红外光谱检测结果显示五个组分官能团相似,在3600～3200 cm-1、2970～2840 cm-1、1640～1540 cm-1、1430～1290 cm-1、1200～1000 cm-1处有吸收峰,推测五种多糖均为吡喃糖,且BJP-0可能具有α-型糖苷键,BJP-2、BJP-3、BJP-4可能具有β-型糖苷键。用HPGPC法测定黑枣多糖平均分子量,结果如下:BJP-0（1.50×10~4Da）、BJP-1（1.36×10~4Da）、BJP-2（1.33×10~5Da）、BJP-3（1.19×10~5Da）、BJP-4（1.23×10~5Da）。用HPAEC法测定黑枣多糖的单糖组成,结果如下:BJP-0（Ara:Gal:Glc:Man:Xy l:Fru=76.71:11.29:5.35:0.78:4.56:1.31）、BJP-1（Ara:Gal:Glc:Man:Xyl:Fru:Gal A=44.46:39.27:7.33:1.92:1.38:2.04:3.59）、BJP-2（Rha:Ara:Gal:Glc:Xyl:Fru:Gal A=0.43:13.37:61.57:0.71:0.54:0.58:22.80）、BJP-3（Rha:Ara:Gal:Glc:Man:Xyl:Gal A=10.38:18.88:9.93:1.68:0.08:1.57:57.48）、BJP-4（Ara:Gal:Glc:Man:Fru:Gal A=34.74:15.38:3.02:3.85:9.58:33.42）。BJP-3在纯化后多糖组分中回收率最高,对其进行甲基化和核磁共振光谱分析。在甲基化分析中,发现并鉴定了十个衍生产物:Araf（1→、→5）Araf（1→、→2）Rhap（1→、→2,4）Rhap(1→、Galp（1→、→3,4）Galp（1→、→4,6）Galp（1→、→4）Galp A(1→、Xylp（1→和→4）Manp(1→,其摩尔百分比为10.45:6.52:4.85:3.46:6.16:1.29:1.82:57.70:1.44:3.06。核磁共振光谱分析结合甲基化分析结果推测BJP-3包含两个单位:T-β-D-Galp（1→4）-α-D-Gal Ap（1→OMe）和T-α-L-Araf（1→5）-α-L-Araf(1→。（3）黑枣多糖的抗氧化活性化学水平抗氧化活性:以Vc为对照,比较了BJP与纯化后五种组分的抗氧化活性。在清除DPPH自由基实验中,BJP、BJP-0、BJP-1、BJP-2、BJP-3和BJP-4的IC50值分别为0.24、0.79、0.38、0.68、1.19和0.54 mg/m L。在清除ABTS+自由基实验中,BJP、BJP-0、BJP-1、BJP-2、BJP-3和BJP-4的IC50值分别为0.16、0.91、0.31、0.44、0.99和0.58 mg/m L。总还原力测定结果表明,BJP、BJP-0、BJP-1、BJP-2、BJP-3和BJP-4在浓度为1 mg/m L时的吸光度分别为0.448,0.112,0.263,0.194,0.094和0.127。三种实验中BJP的抗氧化活性均最好。细胞水平抗氧化活性:主要研究了BJP对H2O2诱导的HUVEC细胞氧化损伤的保护作用,通过MTT实验、细胞形态观察、MMP检测、Hoechst 33258细胞凋亡检测、ROS水平检测进行评价。结果表明:BJP能够增加细胞存活率,保护细胞形态,抑制线粒体功能障碍,减少细胞凋亡,降低ROS水平,说明BJP对H2O2损伤的HUVEC细胞有很好的保护作用。（4）黑枣多糖产品标准起草了黑枣多糖产品标准。从感官指标、理化指标等方面进行了要求,为产品走向市场提供了依据。
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