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目的:
(1)通过现况调查阐明铝职业接触人群的MCI患病情况,建立铝职业接触人群所引起的tau蛋白异常磷酸化位点与MCI之间的联系;
(2)通过体内实验探讨三氯化铝对小鼠学习记忆能力的影响及其与脑组织tau蛋白异常磷酸化表达的关联性;
(3)在人群研究,体内实验的基础上,进行体外实验,采用人源性神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y),利用钙调蛋白激酶-Ⅱ(CaMK-Ⅱ)拮抗剂KN93和蛋白磷酸酶-2A(PP-2A)激动剂神经鞘氨醇,以对抗tau蛋白的过度磷酸化研究铝致tau蛋白异常磷酸化的机制。
方法:
(1)选取某电解铝厂其电解车间66名退休工人作为接触组,对照工人来自同一地区的某面粉厂退休工人70名,采用简短精神状态量表(MMSE)筛选MCI患者;同时采集所有研究对象空腹肘静脉血,分离血清,采用电感耦合等离子质谱法(ICP-MAS)测定血清铝含量;分离淋巴细胞提取其蛋白,用western blot测定淋巴细胞P-tau181、231、262、396磷酸化程度以及总tau(tau5)表达水平;分析两组间血铝浓度、MCI检出率、P-tau181、231、262、396及tau5表达的变化情况,同时应用多元统计学方法探讨MMSE得分的影响因素,血铝水平与MCI患病率的关联性,MMSE得分、血铝水平与P-tau181、231、262、396及tau5表达的相关性。
(2)选取刚断乳的昆明种小白鼠共320只,按体重随机分为4组,每组80只,雌雄各半,分笼饲养。将AIC13混入饲料中喂养小鼠,分为高、中、低剂量组,剂量分别为120,12,1.2mg/kg.d,对照组正常饲养。染毒时间为2年,每半年进行相应指标的测定,采用水迷宫实验、避暗实验、跳台实验检测小鼠的认知功能;神经行为测定完毕后处死小鼠取脑组织,采用电感耦合等离子质谱法(ICP-MAS)测定血清铝水平和脑铝含量;应用HE染色和电镜观察小鼠脑组织的变化;提取脑组织蛋白用Western-blot检测小鼠脑组织P-tau181、231、262、396及tau5表达情况;分析不同剂量、不同时间小鼠学习记忆的变化,及其与血铝、脑铝、脑组织P-tau181、231、262、396及tau5表达的变化的关联。
(3)选取SH-SY5Y细胞进行染毒,实验分组分为空白对照、200μM AL3+、400μM AL3+、800μM AL3+、800μM AL3++0.5μMKN93、800μM AL3++5nM神经鞘氨醇、800μM AL3++DMSO、DMSO,染毒和干预48小时后测定各项指标。采用CCK-8法测定细胞活力;采用Flu-3AM标记,应用流式细胞术测定细胞内Ca2+浓度;用ELISA方法测定CaM含量、CaMK-Ⅱ含量、PP-2A含量;提取细胞蛋白用Western-blot检测细胞蛋白P-tau181、231、262、396及tau5表达情况;分析CaMK-Ⅱ拮抗剂KN93和PP-2A激动剂神经鞘氨醇对抗Tau蛋白的异常磷酸化。
结论:人群研究结果提示长期铝接触可引起工人的认知功能障碍,可能是MCI发病的危险因素之一,高龄、男性和文化水平低、血铝水平高可能是认知功能障碍的高危因素;而淋巴细胞P-tau396、P-tau231、P-tau181的表达更适合监测铝作业人员认知功能的下降。体内实验研究提示长期喂养三氯化铝可引起小鼠学习记忆功能的下降,其下降程度与染铝剂量和染铝时间有关;海马组织是负责学习记忆功能解剖结构,从病理结果显示三氯化铝可以引起海马区神经细胞的变化,细胞的超微结构显示细胞内线粒体、内质网和突触均受到损害;脑组织tau5、P-tau396、P-tau262、P-tau231的表达也随着染铝剂量剂量的增加表达增高,P-tau262、P-tau231蛋白表达变化除与剂量有关还与时间有关。提示长期染铝导致小鼠学记忆功能的障碍与磷酸化tau蛋白的异常表达有关。体外干预实验结果提示三氯化铝可引起SH-SY5Y细胞tau5、P-tau396、P-tau231、P-tau181表达的异常,其机制与由Ca2+/CaM调控的CaMK-Ⅱ和PP2A活性的变化有关,实验结果提示铝可以升高细胞内Ca2+浓度和CaM含量,从而激发CaMK-Ⅱ活性,抑制PP2A活性,使tau蛋白磷酸化平衡被破坏,而PP2A的激动剂神经鞘氨醇对铝引发的tau蛋白异常磷酸化的拮抗效果更为明显。提示铝致tau蛋白异常磷酸化与PP2A活性受到抑制密切相关。