乳腺癌是女性排名第一的恶性肿瘤,乳腺癌的早期诊断和治疗对增长患者生存期具有重要意义。乳腺癌患者的外周血中除了特殊蛋白、核酸等常规的血清标志物外,还存在一些微尺度的纳米囊泡,研究发现,这些纳米囊泡可作为乳腺癌早期诊断的生物标志物。外泌体是脂质包封的纳米级囊泡中的一种,肿瘤来源的外泌体包含很多癌蛋白、mRNA等肿瘤特异性分子标志物,外泌体可以充当细胞间的分子信使,参与肿瘤细胞和微环境之间的信号传导。此外,由于肿瘤细胞表面外泌体分泌旺盛,且可以从体液中分离出来,因此,在液体活检中,外泌体被认为是一种重要的生物标志物,在癌症的诊断、预后和治疗等方面拥有巨大的潜力。到目前为止,关于外泌体检测的研究已经有很多报道,但是方便、低成本的检测方法还亟待开发。基于此,我们提出了两种省时低耗的外泌体检测方法,一种是利用G-四链体DNA过氧化物模拟酶实现高灵敏度的外泌体检测;第二种方法以不规则的四面体DNA结构为支架,串联天然酶与人工酶(G-四链体),通过酶级联信号放大实现外泌体检测。本论文的主要研究内容如下:1、基于氯化血红素(hemin)/G-四链体模拟辣根过氧化物酶(HRP)的优越性,我们将高特异性的muc1粘蛋白(MUC1)适配体与hemin/G-四链体结合,通过设计一种类似发夹的结构,开发出一种结构简单、成本低廉、灵敏度高的比色传感器,用于检测乳腺癌外泌体。Hemin/G-四链体具有HRP的催化活性,通过还原H2O2产生明显的比色反应。此探针可实现“开-关”的转换,严格控制外泌体存在与否时反应的进程。在我们的研究中,相关的外泌体检测限为3.94×105粒子/mL,与商业ELISA相比具有更高的灵敏度。该方法不仅具有方便、省时等优点,而且不需要使用复杂的仪器,产生的信号可以用肉眼观察到。此外,该策略可以很好地区分乳腺癌患者和健康个体,在临床样本分析中具有潜在的应用价值。2、通过搭建四面体支架结构,架载蛋白酶分子实现酶级联反应,用于乳腺癌外泌体的检测。四面体作为一种DNA支架结构,与传统菌核骨架相比,避免了可控性差、生物相容性差的缺点。利用四面体的刚性及结构可控性特点,我们对四面体边长进行改造,将其中两条边设计为特殊的单链功能序列,并与包含蛋白适配体的封闭链通过碱基互补配对结合。此功能序列包括两部分:一是与外泌体蛋白适配体互补的序列,二是富含鸟嘌呤的DNA序列,当缺少靶外泌体时,探针无法发挥类似过氧化物酶活性;当加入外泌体样品后,适配体序列与其结合,封闭链脱离四面体,模拟酶序列暴露,并在hemin的作用下,形成hemin/G-四链体二级空间结构,发挥类似过氧化物酶的功能。Hemin/G-四链体的形成使得天然蛋白酶分子之间以及与HRP模拟酶间在空间上得以接近。在发生酶解反应后,H2O2在hemin/G-四链体周围空间高浓度积累,达到酶级联放大效果。这一策略为开发新的可靠的支架材料和构建新型生物传感器奠定了基础,对早期癌症诊断和传感分析有重要意义。