论文部分内容阅读
马唐是世界18种恶性杂草之一,目前的防治主要以化学除草剂为主。但是,随着化学除草剂的广泛应用,随之而来的环境污染、杂草耐药性提高等问题也日益加重。生物防治因其对环境友好和高度选择性等优点逐步成为研究热点。本实验室从马唐罹病叶片上分离得到炭疽病病原菌Col-68(Colletotrichum sp.),前期试验研究表明,该菌对马唐具有很强的致病力,但并不侵染水稻、棉花、玉米、大豆、小麦、花生等经济作物及主要草坪草,具有很高的生物安全性。为明确该菌的生理特性,更好的利用该菌开展生物防治,对其生物学特性进行了研究,并进行了遗传改良。
生物学特性分析结果表明,菌丝体在15~35℃均可生长和产孢,在马唐汁培养基上生长最好,5天后菌落直径为8.01 cm,在PSA培养基上产孢最多,15天后产孢量可达5.55×106个/皿;该菌株最适生长和产孢的温度及初始pH值均为28℃和6.5,光照有利于产孢。分生孢子萌发最适温度为35℃,最适初始pH值为6.5,黑暗有利于孢子萌发;分生孢子温热致死温度和时间为53℃/10 min。通过不同液体培养基发酵培养,发现该菌在麸皮液体培养基中产孢最好,3天后产孢量可达106个/mL。综上所述,马唐致病真菌Col-68生长条件广泛,并且具备良好的发酵条件,已经具备了真菌除草剂候选菌株的基本条件,是马唐生防菌的潜力菌株。
为了提高菌株Col-68的产孢量和生防效果,采用紫外诱变和根癌农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)的方法对菌株Col-68进行遗传改良。
通过紫外诱变,从153个稳定的诱变菌株中筛选到产孢能力增强菌株1株(ZW84),其产孢量可达107个/皿;此外通过致病性测定,筛选到对马唐生防效果增强菌株6株(ZW8,ZW15,ZW17,ZW49,ZW61,ZW84),其中ZW84对马唐的防除效果最佳。
通过农杆菌介导转化,经过潮霉素的二次筛选,共获得约200个稳定遗传的转化子,转化效率为平均每106个分生孢子可得到150~200个转化子。对随机挑取的转化子进行PCR检测、荧光观察和Southern杂交检测结果表明T-DNA已经成功插入到炭疽病菌的基因组中。通过生物学特性分析,筛选到产孢量增强菌株2株(ZH12和ZH18),其中ZH18的产孢量达到107个/皿。此外,致病性测定结果表明,ZH2,ZH16,ZH18,ZH22和ZH23这5株转化菌株的生防效果均比野生型高。将这11株突变菌株作为工业生产候选菌株,为进一步开发研究该菌成为工程菌和进行工业化生产打下基础。