研究背景和目的剪切是基因转录后重要的修饰过程,主要作用是将不成熟mRNA中的内含子切除,将外显子连接起来。剪切主要发生在细胞核的剪切体,剪切体包含5个小核内核糖核蛋白(U1,U2,U4,U5和U6snRNP)以及150个以上的蛋白质。在剪切过程中外显子的识别主要是由剪切位点介导,因此剪切过程是多变的,辅助性剪切因子可以推动剪切体通过对剪切位点的识别决定留下还是切除某些外显子,这就是选择性剪切的发生机制。因此对选择性剪切位点的识别就显得非常重要,并且也越来越受到关注。剪切因子SF3B1是U2-snRNP的核心成分,它能识别待剪切基因3’末端上游侧枝的剪切位点,并能稳定U2-shRNP与该剪切位点之间的结合,因此在剪切过程中发挥重要的作用。近年来随着基因测序技术的发展,在肿瘤中发现了一大批与剪切相关的基因发生高频突变,而其中突变频率最高的就是SF3B1,在血液系统疾病骨髓增生异常综合症的亚型RARS中突变频率更是高达80%左右。RARS全名是难治性贫血伴环形铁粒幼细胞增多症,主要生物学特点是骨髓红系生成障碍,而在临床上主要表现为恶性贫血。在RARS中SF3B1选择性特异性高频突变使得我们相信该基因与骨髓红细胞生成有密切的关系。红细胞生成是一个复杂的过程,它包括早期红细胞生成和红细胞终末期分化两个阶段。早期红细胞生成是指从造血干细胞CD34+细胞分化成红系祖细胞BFU-E和CFU-E,而红系终末期分化则是从生成具有形态学可识别的原始红细胞开始,原始红细胞经历一系列有丝分裂,先后分化成早幼红细胞、中幼红细胞和晚幼红细胞,然后经历细胞脱核分化成网织红细胞而走向成熟。中间任何一个过程出现问题都会导致红细胞生成障碍从而引起贫血的发生。为了研究SF3B1和红细胞生成之间的关系,进一步了解SF3B1在RARS发病中的机制,我们在人外周血造血干细胞实施了慢病毒介导的SF3B1的敲低实验,在体外将细胞进行红系诱导培养,期间观察细胞增殖、分化、脱核和凋亡的情况,并采用RNA测序通过生物信息学分析进一步了解上述表型发生的分子机制,最后对筛选出的目的基因进行进一步研究验证我们之前得到的结论。第一部分干细胞水平对SF3B1基因敲低对红系增殖及分化作用的研究材料和方法1.分析既往RNA测序结果了解SF3B1在红系分化过程中mRNA表达情况;分离人外周血造血干细胞CD34+细胞,使用三阶段培养体系向红系诱导培养,收集不同培养阶段的细胞通过Western Blotting 了解SF3B1在红系不同分化阶段蛋白表达水平。2.在人外周血造血干细胞实施慢病毒介导的SF3B1敲低,然后通过克隆形成实验、EdU介导的细胞周期检测和凋亡检测了解SF3B1敲低对红系早期分化过程的影响。接着通过流式细胞仪检测红系终末期分化过程中细胞的增殖、分化、脱核和凋亡情况,并使用DNA ladder验证细胞的凋亡。同时使用显微镜观察细胞形态,了解SF3B1敲低对红系期终末分化细胞的影响。3.使用荧光激发的流式分选技术对SF3B1敲低细胞和Luciferase对照组细胞进行流式分选,对分选纯化的细胞进行克隆形成实验,进一步研究SF3B1敲低对红系早期分化细胞的影响,同时对分选的细胞进行形态观察了解细胞核畸形发生的时期,并对核畸形进行量化。实验结果1.RNA-seq结果分析发现SF3B1 mRNA在红系分化过程的每个阶段均呈现较高的表达;与基因表达水平基本一致,Western Blotting结果显示SF3B1蛋白在红系各个分化阶段也均呈现较高水平的表达,但是随着分化的进行表达量逐渐下降。2.慢病毒介导的SF3B1对人外周血CD34+敲低效率在60%左右;SF3B1敲低严重影响了红系造血祖细胞的增殖,克隆形成实验结果显示,SF3B1敲低后d6的克隆形成实验显示接种400个细胞,Luciferase对照组可以形成BFU-E 37个,CFU-E 102个,而SF3B1 KD组则分别只有8个和14个,两组差异具有明显的统计学意义(p<0.001)。用流式分选的BFU-E和CFU-E行克隆形成实验我们得到了相同的结果。凋亡检测结果显示在d6,SF3B1 KD组凋亡比例在20%左右,而对照组细胞仅为5%,差异具有统计学意义(p<0.001)。3.SF3B1敲低严重影响了红系终末期细胞分化,在d7显示红系终末期细胞分化的标志性表面分子GPA在Luciferase对照组细胞达到40%左右,而在SF3B1 KD组仅为不到20%。在随后培养阶段中用Band3和α4-intetrin检测红系分化结果发现,在细胞培养的d9至d13,与Luciferase对照组相比SF3B1 KD组细胞分化出现了明显的延迟,然而在培养至d15和d17,SF3B1 KD组的细胞分化又赶上了 Luciferase对照组。4.SF3B1敲低使红系的细胞生长受到明显抑制,生长曲线显示Luciferase对照组细胞从培养的d7到d15,细胞从1 million增殖到90 million左右,而SF3B1 KD组仅从1 million增殖到20 million左右。5.流式细胞检测结果和DNAladder检测结果均显示SF3B1敲低严重导致了细胞凋亡的发生,EdU细胞周期检测结果显示SF3B1敲低引起了细胞周期阻滞。6.SF3B1敲低导致红系终末分化晚期的细胞出现双核、多核及核碎裂等核畸形,用流式分选纯化的细胞进行研究发现,这种核畸形主要发生在Poly和Ortho期,在这两期核畸形的比例分别为30%和40%,而在Luciferase对照组这一比例均低于5%。小结1.SF3B1敲低严重影响了红系造血祖细胞的细胞增殖,严重影响了红系终末分化期细胞的增殖、分化、脱核和凋亡。2.SF3B1敲低引起红系分化过程中细胞增殖障碍是由于细胞凋亡增加和细胞周期阻滞引起。3.SF3B1敲低引起红系终末分化过程中Poly和Ortho两期细胞出现双核、多核、核碎裂等核畸形。第二部分四环素诱导慢病毒表达载体的构建及其在SF3B1基因敲低对红系分化影响中的应用材料和方法1.使用质粒pTRIPZ作为辅助质粒,将含有SF3B1-shRNA的片段克隆入载体pTRIPZ-EF1α-GFP,构建四环素诱导的绿色荧光蛋白表达载体iGFP-shRNA-EF1α-pTRIPZ 以及对照质粒 iGFP-scramble-EF1α-pTRIPZ。2.包装四环素诱导的绿色荧光蛋白表达载体iGFP-scramble-EF1α-pTRIPZ的慢病毒颗粒,在人外周血造血干细胞CD34+实施慢病毒介导的转染,加入Doxycycline诱导后,分别在诱导后的6h,12h,24h,36h,48h,72h用荧光显微镜和流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达情况,并在不同时间点收集细胞观察细胞形态同时使用流式细胞仪检测可诱导表达载体对红细胞分化和脱核的影响,将这些表型与正常对照Luciferase进行对比,了解该四环素诱导表达载体在红系终末期分化细胞中进行基因编辑的可行性。3.准备四环素诱导的绿色荧光表达载体iGFP-SF3B1-EF1α-pTRIPZ的慢病毒颗粒,进行病毒转染之后常规培养细胞,并分别在加入加入Doxycycline诱导后 6h,12h,24h,36h,48h,72h 收集细胞,通过 RealTimeRT-PCR 了解诱导后SF3B1 mRNA水平的动态变化,并通过Western Blotting 了解诱导后该基因蛋白水平的动态变化。4.在转染后不同培养阶段分别诱导SF3B1-shRNA的表达,分别检测敲低效率,并用流式细胞仪观察细胞凋亡的发生,了解细胞不同分化阶段敲低SF3B1细胞凋亡的发生情况。实验结果1.荧光显微镜和流式细胞仪检测四环素诱导表达载体在Doxycycline诱导后6h,绿色荧光蛋白开始表达,至24h荧光强度达高峰。2.四环素诱导表达载体在红系终末期细胞分化过程中不影响细胞形态、分化和脱核。3.SF3B1可诱导表达载体在加入Doxycycline诱导后6h mRNA水平开始出现下降,至24h达到平台期,这与绿色荧光蛋白的表达一致;SF3B1蛋白水平的降低落后于mRNA水平,在诱导后48h出现表达降低。4.在红系终末期细胞分化的不同阶段诱导SF3BIshRNA表达,用流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示不同时间点诱导shRNA表达均可达到一致的敲低效率,但只有在细胞分化的早期d4和d7诱导敲低细胞才出现细胞凋亡,在终末分化的中期和晚期诱导均观察不到细胞凋亡的发生。小结1.慢病毒介导的四环素诱导表达载体在人类原代造血干细胞具有很好的转染效率和敲低效率,并且shRNA与GFP由同一个启动子控制,该启动子为四环素诱导表达,因此基因的敲低与GFP的表达一致。2.使用四环素诱导表达载体在红系分化的不同阶段敲低SF3B1均可产生同样的敲低效率,但只有在红系早期分化的阶段(相当于CUF-E阶段)诱导才导致细胞凋亡的发生。第三部分SF3B1敲低引起红系造血障碍与p53通路激活关系研究材料和方法1.对流式分选纯化的各分化阶段细胞提取总RNA,利用illuminaTruSeq kit构建cDNA表达文库,随后进行RNA测序。2.对RNA测序结果进行分析,使用cummerbund R package等软件对测序结果进行生物信息学分析,计算各基因的表达量,寻找差异表达的基因,同时使用spliceR软件对剪切的差异表达进行分析。3.筛选生物信息学分析结果,锁定目标基因MKRN1和p53通路以及与细胞分裂相关的代谢通路,通过Real Time RT-PCR和Western Blotting对测序结果进行验证,并设计引物对SF3B1敲低后部分剪切异常基因进行检测,进一步了解SF3B1敲低对剪切的影响。4.使用MSCV-IRES-GFP和pcDNA3-Flag-MKRN1辅助质粒,将含有人类全长MKRN1的片段克隆进入pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体,从而构建过表达MKRN1的载体pGFP-MKRN1。5.在SF3B1敲低的细胞过表达MKRN1 了解对细胞增殖及凋亡的逆转作用,进一步了解SF3B1与p53通路之间的关系。6.使用PLK1抑制剂作用红系终末期分化细胞,了解该抑制剂对细胞核畸形的影响,验证SF3B1敲低破坏了红系终末分化阶段细胞核有丝分裂/细胞质分裂的通路。实验结果1.RNA测序结果显示在纯化的CFU-E阶段有255个基因出现差异化表达,其中167个基因出现表达的下调,88个基因出现了表达的上调。采用GSEA分析发现,在SF3B1敲低后上调的通路中变化最大的通路是p53代谢通路。RNA测序结果显示与p53代谢通路相关的基因p21,Bax和PUMA的mRNA水平在CUF-E SF3B1敲低组出现了明显的升高,Real Time RT-PCR的结果验证了这些变化。2.生物信息学对剪切过程分析发现,大约288个基因在SF3B1敲低的CFU-E阶段发生了差异性剪切变化,主要的剪切变化类型有外显子跳读/增加,转录起始位点改变,转录终止位点改变。我们用Real Time PCR的方法对其中15个剪切变化基因进行分析发现和RNA测序结果基本一致,说明SF3B1敲低对细胞mRNA的剪切发挥了重要的作用。3.我们对出现剪切差异表达最大的基因之一 MKRN1进行研究发现,无论在mRNA水平还是蛋白水平,在SF3B1敲低的实验组MKRN1均出现了表达的下降。使用MKRN1过表达载体对SF3B1敲低的细胞进行MKRN1 Large isoform过表达研究发现,MKRN1过表达能部分逆转SF3B1造成的细胞增殖抑制。4.生物信息学研究发现在红系终末分化的晚期Poly和Ortho期细胞均出现了细胞核有丝分裂/细胞质分裂代谢通路的下调,其中一个重要的基因是PLK1。使用PLK1抑制剂对红系分化终末期的细胞进行研究发现PLK1抑制剂能引起细胞出现明显的核畸形,这一表型和SF3B1敲低引起的结果一致。小结1.SF3B1敲低导致的细胞凋亡和细胞周期阻滞是由于一种E3连接酶MKRN1的选择性剪切从而激活了p53通路而引起的。2.SF3B1敲低在红系终末期分化细胞Poly和Ortho期导致的核畸形与细胞核有丝分裂/细胞质分裂通路基因表达降低相关。结论1.SF3B1敲低导致了人类红细胞生成过程中出现凋亡、细胞周期阻滞及在Poly和Ortho期产生双核、多核及核碎裂等核畸形。2.凋亡和细胞周期阻滞是由于一种泛素连接酶MKRN1的选择性剪切从而激活了 p53代谢通路。3.在红系终末期分化细胞的Poly和Ortho期,双核、多核及核碎裂等核畸形的产生是由于有丝分裂/胞质分裂代谢通路的下调导致的。4.我们构建了一个可以在分化细胞进行基因编辑的四环素诱导表达载体,利用该载体我们发现SF3B1引起细胞凋亡主要发生在红细胞分化的CFU-E阶段。