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研究目的：本研究通过构建PARP1基因的发卡样siRNA(smallinterfereRNA)真核表达载体，利用siRNA载体来抑制PARP1基因的表达，从而探索PARP1蛋白在氢醌细胞毒作用以及DNA甲基化过程中的作用，为进一步研究PARP1的功能奠定基础。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞人支气管上皮细胞(HBE)由广州医学院馈赠，细胞以DMEM/10％FCS，37℃，5％CO2培养，常规培养传代。
1.1.2菌株大肠杆菌DH5α菌株由本教研室保存。
1.1.3质粒载体RNAi-ReadypSIREN-RetroVector购于美国Clontech公司，全长6.4kb，是一带有BamHI和EcoRI两酶切位点的线性载体；pEGFP-C1绿色荧光蛋白载体购于美国Clontech公司，全长4.7kb。
1.2方法
1.2.1发卡样PARP1基因siRNA逆转录病毒载体构建根据GenBank提供的PARP1基因cDNA序列，通过BD公司提供的软件以及BLAST挑选长为19个碱基的特异性寡核苷酸序列(5-ATCTTCTCAAGGCAGACAC-3)，合成其发卡样两端配对siRNA寡核苷酸链，同时合成互补链，分别在5和3端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。将上下链经过变性、复性后形成双链PARP1siRNA。采用DNA重组技术，将PARP1siRNA双链定向克隆入U6启动子指导的逆转录病毒表达载体RNAi-ReadypSIREN-RetroQVector。转化连接子，37℃培养过夜，长出的单个单菌落为转化菌菌落。挑单菌落种于10mlLB(含60μg/ml氨苄青霉素)中，37℃摇菌过夜。收集细菌，按说明书操作小量快速抽提质粒DNA，1％的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
1.2.2pEGFP-C1-PARP1siRNA真核表达载体构建选择酶切位点，将包括U6启动子和siRNA序列的片段切下，并亚克隆至入CMV启动子指导的pEGFP-C1荧光蛋白表达载体。转化连接子，37℃培养过夜，长出的单个单菌落为转化菌菌落。挑单菌落种于10mlLB(含50μg/ml卡那霉素)中，37℃摇菌过夜。收集细菌，按说明书操作小量快速抽提质粒DNA，1％的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
1.2.3PARP1蛋白缺陷细胞建立HBE细胞常规培养于含10％小牛血清的DMEM培养液，稳定传代后用于本实验。90％融合的HBE细胞，分别转染5μgpEGFP-C1-NegsiRNA、pEGFP-C1-PARPlsiRNA(LIPOFECTIN法)，同时设未转染对照。细胞转染48h，换含800μg/lG418、10％小牛血清的DMEM培养液，筛选10-14天，收集细胞，加细胞裂解液PMSF，提取细胞全蛋白。取50μg细胞全蛋白，10％SDS2PAGE电泳，转PVDF膜，1∶500鼠抗人PARP1单抗，Westernblotting检测胞内PARP1的蛋白水平。
1.2.4PARP1蛋白缺陷细胞生物学性状研究通过观察转染细胞生长形态、超微结构、生长特性及细胞周期等生物学特性，了解转染细胞恶性程度情况。
1.2.5PARP1蛋白缺陷细胞对毒物作用的影响以PARP1蛋白缺陷细胞株为模型，用标准断裂剂氢醌(hydroquinone,HQ)染毒，从微核形成率及细胞周期等方面测定细胞遗传毒性，以研究PARP1蛋白功能及其缺陷细胞对HQ细胞毒作用的影响。
1.2.6PARP1蛋白缺陷细胞对DNA甲基化的影响HQ作用PARP1蛋白缺陷细胞后，用甲基化特异性PCR检测其中p16RASSF1A基因启动子区甲基化情况，从RNA及蛋白水平检测p16RASSF1A的表达。2、结果2.1发卡样PARP1基因siRNA设计逆转录病毒载体构建根据GenBank提供的PARP1基因cDNA序列，合成两对发卡样siRNA寡核苷酸链，命名为P1，P2。通过分子克隆和琼脂糖凝胶电泳鉴定，成功构建了发卡样PARP1基因siRNA逆转录病毒载体。同时构建阴性siRNA逆转录病毒载体。
2.2pEGFP-C1-P1siRNA和pEGFP-C1-P2siRNA真核表达载体的构建经过亚克隆和琼脂糖凝胶电泳鉴定，成功获得pEGFP-C1-P1siRNA和pEGFP-C1-P2-siRNA真核表达载体。同时构建阴性siRNA荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1-NsiRNA。
2.3PARP1蛋白缺陷细胞建立对于三种质粒用脂质体法转染HBE细胞48h后，在荧光显微镜下观察到细胞绿色荧光蛋白表达，正式转染成功，分别命名为HBEP1，HBEP2和HBEN，G418筛选后，提取细胞全蛋白，Westernblotting鉴定，结果发现三者的PARP1蛋白表达分别为92.4％，17.8％和95.2％。说明pEGFP-C1-P2-siRNA载体能够明显抑制HBE细胞的PARP1表达。所以在后续实验中使用该载体进行研究，将相应转染的细胞命名HBEP细胞。
2.4PARP1蛋白缺陷细胞生物学性状研究
2.4.1细胞生长形态观察转染初期HBEN、HBEP细胞形态变化明显，失去类圆形生长，细胞内颗粒明显增多，细胞形态成不规则型，但随着传代培养时间的增加，3种细胞形态趋于一致。
2.4.2细胞超微结构变化HBE细胞核膜清晰完整，核仁明显，线粒体膜完整，嵴明显；HBEN、HBEP细胞形状不规则，细胞核缩小、变形，胞浆出现空泡，基质不明显，嵴消失。
2.4.3细胞生长曲线3种细胞生长曲线均呈“S”形；三者生长速度接近。表明PARP1蛋白缺陷对细胞增殖能力无明显影响。
2.4.4细胞周期观察三种细胞在G1、G2和S期的分布无显著性差异(P＞0.05)，提示载体对细胞周期影响不大。
2.5PARP1蛋白缺陷细胞对毒物作用的影响
2.5.1细胞存活率用MTT法测定细胞生长抑制率分析，HQ对HBE和HBEP细胞的生长抑制作用在0～80μmol/L范围内与剂量正相关。
2.5.2HBE和HBEP细胞微核结果HBE、HBEN和HBEP细胞经、HQ染毒后，各剂量组不同程度出现含微核的细胞，含微核的细胞中有一个或数个微核，与各自对照组比较，从20μmol/L的HQ剂量组开始HBE和HBEP细胞的微核率明显增加(P＜0.05)。相关分析结果表明，两种细胞的微核率与HQ剂量间存在量效关系。
2.5.3HBE和HBEP细胞染毒后细胞周期结果随氢醌剂量增加，两组细胞均出现G2期阻滞，以HBEP更为明显。同时，对于HBEP还表现S期阻滞，但HBE细胞没有S期阻滞。
2.5.4HBE和HBEP细胞的彗星实验结果各剂量HQ处理后，两种细胞的彗星实验存在差别。其中HBE细胞表现出DNA损害率与HQ剂量正相关。HBEP细胞在20-100μMHQ处理后，DNA损害率大于HBE，但当HQ剂量增加到160μM时，HBE的DNA损害程度比HBEP细胞严重。
2.6PARP1缺陷与DNA甲基化关系
2.6.1DNMT1的mRNA及蛋白表达：在HQ处理后的HBEP细胞中，DNMT1的表达增加，其RNA水平在染毒后第三天开始见到明显上升(2.5)，第5天达到高峰(5.8)。相应DNMT1的蛋白表达水平也增加。而在HQ处理HBE细胞则DNMT1表达无明显变化。
2.6.2p16和RASSF1A基因启动子区域甲基化状态检测经过HQ处理和未经HQ处理的HBEP细胞，其p16和RASSF1A基因启动子区域的MSP检测，都出现具有甲基化与未甲基化两种条带，而HBE细胞无论HQ处理与否，均只有未甲基化条带。
2.6.3p16和RASSF1A的mRNA表达检测对HBEP细胞进行p16和RASSF1ART-PCR检测，发现相应mRNA表达降低，而在在5-Aza-CdR处理后，则上调。
3、结论：成功利用RNA干扰技术抑制PARP1基因表达，为研究PARP1基因的功能打下基础。
在正常生长环境下，PARP1蛋白缺陷对细胞生长形态、超微结构、生长速度以及细胞周期有轻微的影响。
PARP1参与了细胞HQ所致毒性的应答。且具有双相性，既在中低剂量HQ作用下，PARP1的作用促进细胞修复，在高剂量HQ作用下，由于PARP1过度激活，促进细胞死亡。
PARP1参与了DNA甲基化调节，PARP1催化形成的分支状长链结构能够阻止DNA甲基转移酶的作用。