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人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration,hALR）为从人胎肝组织中克隆到的一种新型的促肝细胞增殖因子，它能显著提高CCL4致肝功能衰竭大鼠的存活率。进一步的研究发现其具有刺激肝细胞DNA合成、抑制肝脏自然杀伤细胞（natural killer cell,NK）、诱导肝线粒体基因表达、参与肝再生、氧化游离巯基以及参与细胞质铁硫蛋白（Fe／S proteins）合成等多种生物学作用。该蛋白最为人们所重视的是其对急慢性肝损伤的保护作用，因此开展重组人肝再生增强因子（recombinant human augmenter of liver regeneration,rhALR）的研究将推动肝再生机制的理论发展，并可最终用于重症肝病的临床救治。 本论文主要工作包括E.coli DH5 α表达rhALR的发酵工艺研究；包涵体蛋白质变性、复性及纯化工艺；重组蛋白的生物活性研究。经过大量实验工作，得到如下结果： 1、确定了发酵表达rhALR的工艺。经优化筛选，采用自行设计的复合培养基（酵母粉11.7g，蛋白胨5g，Na2HPO49g，KH2PO42g，MgSO41.5g，CuSO40.004g，ZnSO4 0.004g，FeSO40.01g，VB10.01g，葡萄糖10g，氨苄青霉素0.01 g，胸腺嘧啶0.008g，蒸馏水定容至1L），发酵过程中以氨水调节pH为7.0，溶氧控制30％左右，30℃培养5h，42℃条件下诱导表达4h，同时于培养2h后开始按0.25g／（L·h）补加葡萄糖，200mL／h流加补料培养基。最终菌体湿重达到30g／L以上，rhALR表达量为30％。 2、完善了包涵体（Inclusion bodies,IBs）洗涤工艺。经洗涤缓冲液Ⅰ（50mmol／L Tris-HCl（pH8.0），2mmol／L EDTA，0.2％Triton X-100）、Ⅱ（50mmol／L Tris-HCl（pH8.0），2mmol／L EDTA,2mol／L脲）、Ⅲ（50mmol／L Tris-HCl（pH8.0），2mmol／L EDTA,70％异丙醇）、Ⅳ（50mmol／L Tris-HCl（pH8.0），2mmol／LE DTA，2％脱氧胆酸钠）依次洗涤，除去了绝大部分菌体碎片与膦脂、杂蛋白等杂质，最终包涵体纯度可达到85％。 3、包涵体蛋白以6 mol／L盐酸胍及50 mmol／L β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol,β-ME）溶解后，于含有0.5mol／L精氨酸的缓冲液中稀释复性72h，活性实验证明复性后的蛋白质恢复了其生物活性。复性蛋白质先以离子交换树脂纯化（Pharmacia DEAE-Sephadex填料；XK50／20（CV=392.5mL）色谱柱；流速10 mL／min；0～0.5 mol／L NaCl洗脱，洗脱体积2000mL），所得目的蛋白峰经浓缩，再经凝胶过滤纯化（Pharmacia Sephadex G-50 fine凝胶；XK16／80（CV=160.76mL）色谱柱；流速1mL／min；以0.9％NaCl洗脱，），最终纯化得到的rhALR蛋白质纯度达到97.9％。浙江穴学 生物系统工程与食吊科学学院 4、SD｝PA＊E测d 山＊＊R巾仰分户吐约15 KD，－：浆休分厂＊约30 KD，X电点几6、H～685U川。氨从暇川；Z分析i厂u］，厂狄扎”1！4n［雌纵成‘厂川沦利I符，采J 从质车 助r山敞) 册吸电离匕卞 时问质消 （；＊＊n气 ＊＊＊。s比dh＊＊。－d＊Sol·puoIVmn。zah0。。u，nc Of mgl二。nass sp＊a。·O。。。删rX M八I。DITOFMS）粘丁 测)trhALR分子聚为 30088 Da。 5、动物实验证明 山＊＊R能够他勾CC！4致芯性川’W伤小鼠的什汛率爿。能修夏受损的肝纠1胞；采川V1dr掺入法正明了亚纵的1；A＊R h＼门能够中u激HTC川’癌纠M过株DNA合成；采川IMTT认川J明了。厂童M们 卜ALR洲”mB够促进NIN3＊3细胞线粒休脱氢酶的活件。 6、采川M＊＊D卜＊0卜MS测人经冰余变性仆X州》b化沏上叮山；上AL！《负l”门｝于最为30780 Da，与川沦俏不符。并通过测定腆蛋；二J酶附解蛋白质肽段分于嫩，证明尿索分肋释放的氰暇盐介变性过从川。。。IJ。山＊LRd北A链1：的帧在腋犹基的 c扶丛反1 口被修忻的山ALR蛋且 质5一fZ增加冒 等u点陇低，问时导致rh＊LR Z，k合F＊D能力阶低，氧化琉从汛性下1坏。通过测定俯＆叫A段分了虽，推测出 山A＊R步1丫。1“能的二硫键纠介力人。 7、通过力复卜过w琶力入＊＊D（门。vh。de巾ne＊＊uofe0u＊，主素腺嘿n－－核计暇）j包涵＜ 蛋门 U介仰夕’jrh八卜R纠介口验illZ 厂fAD为门1A卜民’灶见脓丛枫化酶活性的必从组分，但不影响 山ALR对CCL孜川｝W。小鼠川邻川b的修复刊川】及促进NIN3＊3细胞线粒仆脱氢啊活性的仆川。与 ＊LR卞公X地过戍化斩三二了助上它生K！人门 二J用成小啪纠构和参勺 巨胞质饮｛ 炎I人】介＊ 巨JI勿Uq十川J门川V理论不【。O，认为山＊LR能够独)参U什冉生的训拧。