论文部分内容阅读
作为重要的粮食和饲料作物,籽粒发育和光周期特性是影响玉米产量的关键因素。乙酰鸟氨酸脱酰酶催化N2-乙酰鸟氨酸与水生成醋酸盐和鸟氨酸的反应,在植物中参与果实发育、逆境应答、光周期调节等过程。本研究利用玉米自交系郑58、昌7-2及郑58遗传背景上昌7-2的染色体单片段代换系Z22为材料,在百粒重主效QTL qhkw5-3的定位区间SYM033-SYM108内选择了一个可能与籽粒发育有关的基因——乙酰鸟氨酸脱酰酶(NAOD)编码基因(GRMZM2G181273)为研究对象,对其进行了表达分析、启动子区域克隆、亚细胞定位和转基因功能验证。主要研究结果如下:1.从玉米自交系郑58、昌7-2和单片段代换系Z22中分别克隆得到了Zm NAOD的CDS序列。经序列比对发现,三者的开放阅读框没有碱基的差异,长度均为1344bp,编码447个氨基酸。生物信息学分析表明,Zm NAOD编码蛋白的分子式为C2195H3441N585O661S18,相对分子质量为49.179 k D,理论等电点为5.45,其中赖氨酸和亮氨酸含量最高,均为9.4%;该蛋白属于带负电荷的稳定亲水蛋白,具有高度保守的peptidase_M20结构域,没有信号肽序列及跨膜结构,含有18个磷酸化位点。该蛋白的二级结构中α-螺旋的比例为36.42%,无规则卷曲的比例为34.90%,延伸链的比例为19.91%,β-转角的比例为8.95%;进化分析显示,该蛋白与高粱的NAOD蛋白亲缘关系最近,同源性为97%,与拟南芥At NAOD编码蛋白同源性为60.54%。2.从郑58、昌7-2及Z22中分别克隆得到了Zm NAOD的DNA序列。通过DNA序列与相应的CDS区域序列比对发现,玉米Zm NAOD基因的DNA序列中含有10个外显子与9个内含子;通过三者的DNA序列比对发现,昌7-2与Z22的DNA序列完全相同,而郑58在终止密码子下游出现了一段40bp的缺失和4个SNP的差异。3.对3个自交系的不同器官Zm NAOD基因的表达量进行荧光定量PCR分析的结果显示,在郑58中,Zm NAOD基因的表达量依次为:雄穗>茎>根>叶>籽粒,在昌7-2中为:雄穗>籽粒>茎>叶>根,在Z22中表现为:籽粒>雄穗>根>茎>叶。对授粉后不同时期籽粒中的Zm NAOD基因的q RT-PCR分析表明,Z22与昌7-2的Zm NAOD基因表达量变化规律大致相同,在授粉后0-15d迅速上升之后快速下降;Zm NAOD基因在郑58授粉后0-20d的籽粒中表达量呈上升趋势,此后迅速下降。4.从郑58、昌7-2及Z22中分别克隆得到了长2401bp的启动子区域,通过序列比对显示昌7-2与Z22的序列完全相同,与郑58有2个SNP的差异。利用Plant CARE在线工具对启动子区域中的顺式作用元件的分析表明,该区域内含有胚乳表达元件GCN4-motif、Skn-1_motif,昼夜节律调控元件circadian,光响应元件G-box、GA motif、GAG motif、I-box等,以及少量的激素响应元件、逆境响应元件等。郑58的启动子区域较昌7-2少一个臭氧诱导元件(ARE元件)与一个热响应相关元件(HSE元件)。5.构建p CAMBIA1304-Zm NAOD-GFP载体,利用拟南芥的根上表皮细胞进行亚细胞定位,发现绿色荧光蛋白分布在细胞质和细胞质膜中,遂将玉米NAOD蛋白定位在细胞质中,与预测结果一致。6.构建由Ca MV35S启动子驱动的p CAMBIA1304-Zm NAOD过表达载体,转化野生型拟南芥植株。对纯合转基因拟南芥的表达模式分析结果显示,Zm NOAD基因在不同器官中的表达量顺序为:根>果荚>叶>花序>茎。对转基因拟南芥幼苗10d的黑暗处理结果显示,转基因拟南芥根长显著大于野生型拟南芥。选择表达量相对较高的T3-17、T3-23、T3-26三个株系进行生育期和籽粒性状的表型鉴定,发现转基因株系的生育期显著提前、籽粒的千粒重和粒长显著大于野生型。