脱落酸(abscisic acid,ABA)是一种重要的植物激素,在植物生长发育的诸多方面起着重要的调控作用,包括促进气孔关闭、抑制气孔开放;促进衰老、抑制生长;调节开花时间和植物结实;以及抑制种子萌发和幼苗生长。种子萌发是高等植物发育早期的重要阶段,它开始于种子吸涨,结束于胚根露白。种子吸涨时,细胞的结构会发生改变。干燥种子中受损伤的蛋白质、DNA等生物大分子以及细胞膜、细胞器和细胞骨架等会在吸涨时得到修复。同时,种子中许多代谢活动被激活,包括一些糖类、氨基酸、有机酸和脂类的代谢。细胞内的结构改变和代谢复苏对于种子萌发是必需的,ABA能通过抑制结构改变和代谢复苏来抑制萌发。广义的种子萌发还包括子叶变绿。子叶变绿是萌发后生长阶段的关键发育事件,标志着植物光合作用能力的形成,是新生萌发的植物个体开始自养生长的起点。通常用胚根露白和子叶变绿作为种子萌发实验的统计指标。植物子叶变绿后,生长开始加速,表现在主根迅速伸长,真叶逐次出现并快速长大,鲜重迅速增加等。植物体内的ABA含量和信号转导都与种子萌发和幼苗生长密切相关。大量影响ABA代谢水平和信号转导的突变体能呈现种子萌发相关的表型。比如aba2、cyp707a和abi1至abi5等。AB14、AB15等转录因子对种子萌发的抑制,是通过它们下游具体影响种子萌发活力的靶标基因实现的。此外,与ABA相关的非生物胁迫,比如高盐、高渗和高糖胁迫也能够抑制种子萌发和幼苗生长,因为这些胁迫能显著增加植物体内的ABA含量。赤霉素(gibberellin acid,GA)能拮抗ABA对种子萌发的抑制作用,它和ABA是调控种子萌发最重要的两个激素。其他的植物激素,能通过与二者的cross talk影响种子的萌发。外源施加高浓度的ABA(比如10μM)能够完全抑制种子的萌发,但是低浓度的ABA(比如0.25 μM)只能延缓但不能完全抑制种子的萌发。说明种子中存在某种机制能够解除或者削弱ABA的抑制效应。那么,种子萌发过程中细胞是如何解除ABA的抑制效应的?从ABA信号的接受到即刻的级联反应,是否还有未知的基因参与其中并起着负调控作用?为了寻找这样的基因,并进一步研究ABA抑制种子萌发的机理,我们鉴定到一个在施加外源ABA时种子萌发显著延迟的突变体dgal(Delay of Germination under ABA condition 1)。dga1突变体在外源ABA存在的情况下,胚根露白率,子叶变绿率,相对根长延伸率和相对鲜重都比野生型(WT)显著降低,暗示DGA1基因参与了脱落酸调控的种子萌发和幼苗生长。因为DGA1是一个迄今未见报道的新基因,我们对它展开了深入的研究,主要研究结果如下:1.表型分析发现dgal突变体在种子萌发和幼苗生长阶段对ABA及其相关非生物胁迫(高盐、高渗和高糖胁迫)的敏感性增强。而在其他方面(比如气孔运动对ABA的响应方面)则没有明显的表型。2.预测DGA1基因的编码产物具有信号肽、凝集素、表皮生长因子、跨膜和激酶等结构域。亚细胞定位实验表明全长DGA1蛋白定位在细胞质、细胞核和细胞膜;N端的信号肽和凝集素结构域(DGA1_SB)定位在内质网;除去信号肽、凝集素和表皮生长因子结构域的DGA1△N和激酶结构域(DGA1_KD)与全长DGA1的定位相同。说明DGA1是一个定位在细胞质、细胞膜和细胞核的蛋白,它的信号肽和凝集素结构域具有引导蛋白进入内质网腔的功能,暗示DGA1的凝集素结构域可能在内质网发生糖基化反应。3.体外磷酸化实验证明DGA1的激酶结构域DGA1_KD能够自磷酸化,说明DGA1是一个蛋白激酶。4.qRT-PCR和GUS染色实验表明DGA1主要在萌发中的小苗幼根里表达,且受ABA及其相关非生物胁迫(高盐和高渗胁迫)的调控。5.原生质体转化实验和酵母单杂交实验表明AB14能够与DGA1的启动子结合,并显著增强该启动子的活性;AB15虽不能与DGA1的启动子结合,但能协同AB14显著增强DGA1启动子的活性。6.qRT-PCR,原生质体转化和RNA-seq实验表明:DGA1不能影响ABA的代谢,但能够抑制ABA信号转导;DGA1能影响ABA对GA代谢相关基因GA2ox1和G42ox2的抑制作用;DGA1能影响与种子萌发相关代谢途径中的基因的表达;DGA1能影响叶绿素合成相关基因的表达并影响植物体内叶绿素的含量。7.酵母双杂交和BiFC实验表明DGA1能够与一个U-box型E3连接酶PUB9相互作用。ABA能够加强二者的相互作用,并改变它们的亚细胞定位(从细胞质转移到细胞膜)。体外磷酸化实验检测不到DGA1激酶结构域对PUB9的磷酸化信号,说明DGA1的激酶结构域在体外不能磷酸化PUB9,或者该磷酸化的发生还需要未知辅助因子的参与。