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背景:在《中国心血管病报告2017》中,心血管病死亡占据了中国居民死亡构成的首位,比例在40%以上。不稳定性心绞痛作为一个介于冠心病稳定性心绞痛和急性心肌梗死之间的状态,是心血管系统的常见疾病之一。早在2013年的ACC/AHA的血脂治疗指南里就已经明确了动脉粥样硬化性心血管病(ASCVD)的概念,并且给出了相关风险评估的方法,在如今ASCVD的研究大趋势下,属于其中央型的冠心病及其下属的不稳定性心绞痛也愈发引起重视。用于不稳定性心绞痛病人临床诊断和预后评估的传统标记物效果有限,新型标记物有待开发。近年来,基因相关研究成为热点,有关不稳定性心绞痛基因的报道中尚未有使用高通量测序技术开发全血mRNA、全外显子的探索,为此,该领域充满了无限的可能。因此,本研究通过新一代高通量测序技术检测不稳定性心绞痛病人的mRNA表达水平,以及筛选有冠心病猝死家族史的不稳定性心绞痛病人家系,结合遗传、生物信息学分析找寻可能的不稳定性心绞痛的新型标志物。目的:1.筛选不稳定性心绞痛病人的外周血mRNA表达谱,结合已有资料探讨分析,为不稳定性心绞痛的临床诊断、个体化治疗和预后判断等提供新的依据;2.通过冠心病猝死家系全外显子分析,发现相关基因位点。方法:1.1)根据收住院,排除恶性肿瘤、急性感染性疾病,临床诊断明确为不稳定性心绞痛的病人15人,健康对照人15人,分别使用PAXgene试管采集静脉血2.5ml;2)提取全血mRNA,并纯化;3)外周血mRNA的高通量测序;4)通过R软件、DESeq2进行数据分析比对,采用校正p值、差异倍数,筛选可能作为标记物的基因;5)根据筛选基因在NCBI等相关数据库进行基因功能、基因关联、信号通路分析,并分类;6)找出可能作为不稳定性心绞痛病人可能用于临床的诊断或预后分析的目标基因范围。2.1)根据临床收住院病人,明确诊断为不稳定性心绞痛的病人,并追问家族史,选择有冠心病猝死家族史的家系一个(心源性猝死超过3个),并绘制出家系图;2)在第3、4代人中,使用EDTA管空腹抽取5ml静脉血;3)分别提取并纯化DNA;4)在第3代包含不稳定性心绞痛的人中,进行全外显子高通量测序;5)使用生物信息学方法进行基因相关分析,筛选出致病力强的致病基因;6)在第3、4代人的标本中,进行一代测序验证;7)根据验证结果联合相关生物信息学分析,得到可能携带的易冠心病猝死的基因位点。结果1.1)根据差异倍数筛选出565种基因,其中上调表达的基因80种,下调表达的基因485种;2)筛选差异基因GO功能富集主要在结构分子活性、细胞外基质受体相互作用、神经活性配体-受体相互作用、膜封闭管腔、细胞器腔内、固有免疫等方面的表达;3)筛选差异基因功能在KEGG信号通路上与系统性红斑狼疮、癌症存在着联系,且都与黏着斑有关;2.1)该家系中,ACMG筛查到3个致病变异点分别在4号染色体CEP135(POS 56865814),5 号染色体 LARS(POS145508538),16 号染色体 UTP4(POS 69199289)。可能致病变异位点5个分别位于4号染色体TLL1(POS166996084),5号染色体DMGDH(POS 78338181)和 WDR36(POS110462528),6 号染色体 COL12A1(POS 75836118),以及 16 号染色体 DDX19A(POS 70380905);2)其他方法筛查出的基因变异:SNP剩余564个变异位点,插入及缺失突变剩余202个基因位点,CNV筛查剩余0个变异,显性遗传模式检测到了 SNP对应的18个候选基因和InDel对应的1个候选基因,隐性遗传模式检测到了 SNP对应的1个候选基因和InDel对应的0个候选基因,以及复合杂合变异位点对应的2个候选基因;3)GO功能MF主要富集在蛋白质复合物结合,另外胶原结合、电子载体活性、肌动活动方面也有不少的富集,CC主要富集在细胞内部分、胞内细胞器、细胞质、细胞骨架部分,BP主要富集在细胞成分组织、细胞成分组织生物遗传、细胞分化、细胞发育过程;KEGG通路分析提示,该猝死家系的筛选后基因功能通路主要富集在真核生物核糖体的生物发生方面;4)使用GeneMania对筛选的候选基因进行蛋白功能相互作用网络分析,分析得出结果共1541种不同联系;5)基因-疾病表型关联在DisGetNet数据库未检测到相应信息;6)一代测序验证了高通量测序分析得到的3个致病位点,突变点、基因型相符;7)一代测序还发现了第4代家系成员中的突变基因位点携带者。结论1.1)冠心病不稳定性心绞痛病人确实与健康对照人间存在外周血mRNA表达差异,而且差异有统计学意义;2)冠心病不稳定性心绞痛病人的外周血mRNA下调表达的基因占多数,可能与疾病的病理生理状态有关;3)冠心病不稳定性心绞痛的病人在结构分子活性、细胞外基质受体相互作用、神经活性配体-受体相互作用、膜封闭管腔、细胞器腔内、固有免疫等方面的外周血mRNA可能作为该疾病诊断、治疗和预后判断的新型标记物;4)冠心病不稳定性心绞痛病人可能和系统性红斑狼疮、癌症存在着联系,其中可能有黏着斑的参与,有共同的机制参与疾病的发生、发展。2.1)该冠心病不稳定性心绞痛病人猝死家系中,存在致病基因变异:CEP135、LARS、UTP4,这3个基因突变位点未发现相关报道,很可能与冠心病猝死相关,应纳入不稳定性心绞痛病人中筛选冠心病猝死易感人群的筛查范围;2)一代测序还发现了第4代家系成员中的突变基因位点携带者,为临床追踪、随访提供了有参考价值的信息。