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目的:膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤,也是世界第九大常见的恶性肿瘤。在对膀胱癌致病原因及致病机理的研究上,已经取得了很多突破性的进展,然而,现今对膀胱癌的治疗上主要仍局限于手术治疗及化学治疗,究其原因主要是因为膀胱癌的易复发及易转移特性,这导致现如今对膀胱癌的治疗手段有限。近期,有越来越多的证据表明CARMA3对炎症及肿瘤的发生发展上,起到了至关重要的作用。CARMA3在诸如乳腺癌、肾癌、肺癌及结直肠癌等一系列肿瘤中均呈现高表达。并且,CARMA3被认为是一种癌基因参与调节肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及凋亡等各种肿瘤细胞特性。环状RNA(circRNA)对基因表达的调控作用可通过对微小RNA(microRNA)的海绵吸附作用进而影响肿瘤的发生发展。然而,在膀胱癌中,circRNA的作用及对miRNA的海绵吸附作用罕有报道。因此,本文通过探索circRNA/microRNA/CARMA3通路在膀胱癌中的促癌/抑癌作用以及其详细机制,寻找关键分子标志物,为膀胱癌的有效诊断及治疗奠定理论基础。方法:1.CARMA3上游microRNA的筛选及检测通过对Targetscan,miRWalk,miRBase及Starbase等生物信息学网站分析,筛选与CARMA3 mRNA 3’-UTR区具有碱基互补且高度保守的miRNA,挑选表达丰度低且在膀胱癌中未被研究过的miRNA。从标本库中随机选取40对病理诊断明确的膀胱癌病例,提取癌组织及癌旁组织的总RNA及蛋白;培养7种膀胱癌细胞系及上皮永生化细胞系,提取各自总RNA及蛋白,利用qRT-PCR技术检测CARMA3 mRNA及miRNA表达丰度,利用Western blot实验检测CARMA3蛋白表达情况。分析CARMA3及miRNA在组织中表达相关性。2.miRNA对CARMA3的调控机制及在膀胱癌细胞系中的功能实验对膀胱癌细胞系分别检测转染miRNA模拟物/抑制物后CARMA3 mRNA/蛋白水平变化。根据生物信息学的预测位点,构建野生及突变型双荧光素酶报告基因质粒,判定miRNA与CARMA3 mRNA 3’-UTR区特异性结合。对膀胱癌T24及UMUC3细胞转染miRNA的模拟物/抑制物及对应的阴性对照,利用RTCA实验检测转染后细胞增殖能力;利用Transwell实验检测细胞侵袭及转移能力;利用流式细胞仪技术检测膀胱癌细胞周期及凋亡水平。回复实验检测miRNA对CARMA3的调控及miRNA通过CARMA3对膀胱癌细胞功能实验的影响。3.miRNA上游circRNA的筛选及结合验证利用RNAhybrid等生物信息学网站预测,挑选与所研究miRNA具有碱基互补且未被研究的circRNA。通过双荧光素酶报告基因实验,RNA pulldown试验及RNA免疫沉淀试验,验证预测的circRNA与所研究miRNA具有相同的靶点并且可以与之结合。通过荧光原位杂交试验对预测的circRNA与所研究miRNA进行细胞共定位。4.上游circRNA在膀胱癌中的功能在膀胱癌组织与相应癌旁组织及7种膀胱癌细胞系与上皮永生化细胞中,对所研究circRNA的表达丰度进行检测,并分析circRNA及miRNA在组织中相关性。在膀胱癌细胞系中沉默circRNA,利用RTCA实验检测转染后细胞增殖能力;利用Transwell实验检测细胞侵袭及转移能力;利用流式细胞仪技术检测膀胱癌细胞周期及凋亡水平。进行裸鼠皮下成瘤实验,在4-6周Balb/c裸鼠皮下注射稳转后的UMUC3细胞,观察移植瘤模型的生长情况,并对比不同组别生长情况。取移植瘤进行免疫组化,检测Ki-67变化以判断circRNA对增殖能力的影响;Western blot实验检测不同组别瘤细胞中Bcl-2表达以判断细胞凋亡情况。5.上游circRNA对miRNA的调控作用及机制qRT-PCR及Western blot实验检测内源性过表达/沉默circRNA对CARMA3表达影响。回复实验检测circRNA对miRNA的调控及circRNA通过miRNA调控CARMA3的表达及对膀胱癌细胞功能的影响。6.circRNA对通路激活/抑制的验证Western blot实验检测内源性过表达/沉默circRNA对相应NF-κB通路及P38 MAPK通路变化的影响。结果:1.相较于对应的癌旁组织及上皮永生化细胞,CARMA3在膀胱癌组织中及7种膀胱癌细胞系中呈现高表达。通过生物信息学方法分析预测及双荧光素酶报告基因实验验证发现,miR-146b与CARMA3 mRNA 3’-UTR区特异性结合并且负向调控CARMA3 mRNA及蛋白水平表达。并且miR-146b在膀胱癌组织中及7种膀胱癌细胞系中较相应的癌旁组织及上皮永生化细胞呈现低表达。2.体外实验验证发现,miR-146b具有负向调控膀胱癌细胞增殖、侵袭、转移,促进膀胱癌细胞凋亡及诱导细胞G1/S期阻滞的功能。并且,miR-146b影响膀胱癌细胞增殖、侵袭、转移及凋亡的作用是通过靶向调控CARMA3的方式进而实现的。3.生物信息学方法分析预测发现,circINTS4可能作为内源性竞争RNA吸附miR-146b。通过双荧光素酶报告基因实验,RNA pulldown试验及RNA免疫沉淀试验,证实了circINTS4包含了一个与miR-146b相同的靶点并且可以与之结合。通过荧光原位杂交试验揭示circINTS4与miR-146b共同定位于胞质。内源性抑制/激活circINTS4可负向调控miR-146b表达量升高/降低。4.相较于对应的癌旁组织及上皮永生化细胞,circINTS4在膀胱癌组织中及7种膀胱癌细胞系中呈现高表达,并且circINTS4及miR-146b在组织中表达呈负相关。体外实验验证发现,下调circINTS4可抑制膀胱癌细胞增殖、侵袭、转移,促进膀胱癌细胞凋亡及诱导细胞G1/S期阻滞的功能。在裸鼠体内实验中同样证实了上调circINTS4可以促进移植瘤生长,抑制凋亡。5.内源性过表达/沉默circINTS4可正向调控CARMA3的表达,并且circINTS4调控CARMA3的作用是通过竞争性结合miR-146b的方式实现。体外功能实验研究同样发现,circINTS4影响膀胱癌细胞增殖、侵袭、转移、周期及凋亡的作用是对miR-146b的海绵吸附作用方式进而实现的。6.内源性过表达/沉默circINTS4可激活/抑制NF-κB通路及抑制/激活P38 MAPK通路。并且这种激活或抑制作用是通过CARMA3介导进而实现的。结论:circINTS4能够作为内源性竞争RNA对miR-146b起到海绵吸附作用,进而解除miR-146b对CARMA3表达的抑制作用。circINTS4在膀胱癌中呈现高表达并且通过circINTS4/miR-146b/CARMA3轴充当促癌基因的作用,而且circINTS4还能够调节NF-κB及P38 MAPK通路进而影响膀胱癌的发生发展。这些都为膀胱的有效诊断及治疗奠定理论基础。