非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是一种常见的慢性代谢性疾病,约30%的NAFLD患者同时患有非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis,NASH）,NASH 患者中又有 40.8%进展为肝纤维化,而持续的肝纤维化往往导致肝硬化和肝癌的发生。然而,目前临床上并没有针对NAFLD或肝纤维化等肝损伤的特效药物。茶是世界范围内广受欢迎的一种饮料。茶中含有多种对人体健康有益的成分,尤其是绿茶中活性最强、含量最丰富的儿茶素（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate,EGCG）。目前关于饮用绿茶与慢性肝损伤关系的流行病学研究并无统一的结论。有研究发现饮茶尤其是饮用绿茶与体重、体脂、糖尿病、心血管疾病等肝损伤的危险因素存在显著的负相关,也有研究发现饮茶与肝脏脂肪含量、血清转氨酶水平无显著关联,甚至能增加肝脏脂肪含量。因此,茶对肝损伤的作用需进一步的研究。肝脏药物代谢存在显著的种族特异性,是药代动力学表现出种族差异的主要因素之一。NAFLD、NASH及肝纤维化在不同种族中的患病率,以及茶的摄入量、种类、方式等也具有明显的种族文化差异。绿茶摄入对肝损伤的影响是否存在种族差异尚缺乏充足的证据。美国全国健康和营养调查（National Health and Nutrition Examination Survey,NHANES）是为了评估美国成人和儿童的健康和营养状况,从1999年开始的,每两年进行一次的系列健康调查。该项目采用复杂的多中心分层抽样设计,并考虑样本权重使其具有全国代表性。从1999-2018年共进行了 10次调查,包括101,316名参与者,为分析不同种族NAFLD患病率变化趋势及绿茶摄入与肝损伤的关系提供了可靠的数据。另外,动物体内研究发现,绿茶提取物或EGCG通过调节线粒体氧化应激降低炎症反应以及抑制肝纤维化的关键细胞肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSC）的活化改善肝损伤。EGCG分子结构包括两个三酚基团,是较好的还原剂又是金属离子螯合剂。慢性肝损伤常伴随铁代谢异常,而EGCG作为一种铁螯合剂是否通过调节铁代谢以介导抗肝损伤作用尚不清楚。综上所述,饮用绿茶与非酒精性肝损伤的关联及种族差异并不明确,其作用机制仍需进一步探讨。因此,本研究从三个部分分析饮茶和NAFLD的流行情况、二者之间的关联及其种族差异,并从铁代谢的角度探讨其作用机制。第一部分:美国人群NAFLD患病率、饮茶情况20年的变化趋势研究目的利用NHANES 1999-2018年的数据分析美国各种族人群20年期间NAFLD患病率、饮茶率、人均茶摄入量的变化趋势,并根据2013-2018年的数据分析美国饮茶类型的分布情况。材料与方法共纳入41,177例参与者分析NAFLD患病率,66,025例分析总体饮茶情况。NHANES 2013-2018年的18,097例用于分析红茶、绿茶及其他茶的分布情况,绿茶的饮用率及饮用量。分别在男性和女性中分析1999-2018年20年间各种族（墨西哥裔美国人、非西班牙裔白人、非西班牙裔黑人和其他种族）及各年龄段（＜20岁、20-39岁、40-70岁及＞70岁）人群NAFLD患病率、饮茶率及人均茶摄入量的变化趋势,分析2013-2018年6年间饮茶类型分布情况。NAFLD定义为脂肪肝指数（Fatty liver index,FLI）≥60。24h回顾法调查饮茶与否及茶摄入量。在种族和年龄组间NAFLD患病率及饮茶的差异分别用卡方检验和单因素方差分析进行比较,变化趋势用线性回归进行统计分析。所有分析均考虑了抽样权重、聚类和分层抽样研究设计。结果1999-2000年美国总体NAFLD患病率为37.1%,至2017-2018年上升至44.8%,上升趋势明显。从不同性别来看,患病率男性高于女性（45.3%vs.35.0%）,但女性上升趋势更加显著。从不同种族来看,墨西哥裔美国人、非西班牙裔白人、非西班牙裔黑人、其他种族的总患病率分别为43.4%、40.4%、39.4%、34.6%,差异具有统计学意义（P＜0.001）其中墨西哥裔美国人患病率上升最快,2017-2018年高达50.7%。从不同年龄来看,20岁以下儿童或青少年患病率最低（11.4%）,40-70岁人群患病率最高（53.2%）;70以上老年人患病率（45.5%）上升趋势最显著（P=0.013）。20年间美国人饮茶率逐渐升高（20.8%至27.2%,P-trend＜0.001）,女性高于男性（24.8%vs.20.9%）,人均每天茶摄入量也有轻微的升高趋势（149.3g/d至164.7g/d）。饮茶人群中以饮用红茶（69.9%）为主,其次为绿茶（20.8%）,然后是其他茶（9.3%）。绿茶饮用率在总人群中约占4.9%,女性高于男性（5.2%vs.4.7%）,其他种族最高（7.0%）,2013-2018年绿茶饮用率及饮用量均无显著变化趋势。结论20年间美国总体NAFLD患病率呈显著上升趋势,其中墨西哥裔美国人患病率最高,上升趋势最快,40-70岁患病率高于其他年龄组。饮茶率及人均茶摄入量呈轻微上升趋势,以饮用红茶为主。绿茶总饮用率约4.9%,2013-2018年无显著变化。第二部分:绿茶摄入与非酒精性肝损伤关联分析研究目的利用NHANES数据及苏州地区队列,分析绿茶摄入与非酒精性肝损伤风险的关联。1.绿茶摄入与非酒精性肝损伤的横断面关联分析材料与方法排除NHANES中饮用红茶或其他茶的参与者,最终纳入9,322例绿茶饮用者或不饮茶者分析绿茶摄入与非酒精性肝损伤的关联。除了 NAFLD,还采用AST/ALT 比值及肝纤维化指数4（Fibrosis index 4,FIB4）这两个指数判断肝纤维化损伤情况,指数值越高说明肝纤维化越严重。采用加权二元logistic回归计算绿茶摄入与NAFLD患病风险关联的OR值及95%置信区间（95%CI）,采用加权多元线性回归进行分析绿茶摄入与AST/ALT 比值、FIB-4指数之间的关系。并根据性别、种族、年龄以及是否患有肥胖、糖尿病或高血压进行亚组分析。结果调整混杂因素后,仅在其他种族（OR:0.67,95%CI:0.48-0.94,P＜0.005）发现饮用绿茶与NAFLD患病风险降低显著相关。其他种族进一步分为其他西班牙裔、亚裔和其他种族,仅亚裔人群饮用绿茶与NAFLD风险降低有关（OR:0.52,95%CI:0.34-0.79,P=0.003）。未发现饮用绿茶与AST/ALT 比值、FIB-4指数存在显著关联。2.绿茶摄入与非酒精性肝损伤的纵向关联研究材料与方法2011-2013年在江苏省苏州市招募成年人参与该研究,最终5,131例40-70岁的中老年人纳入该研究,分别在2015年、2017年进行了两次随访,参与者分别有3,464和2,452人,随访率分别为67.5%、47.8%,至少参与一次随访者纳入本研究。NAFLD采用腹部超声进行诊断,采用AST/ALT 比值及FIB-4指数判断肝纤维化损伤情况,半定量食物频率调查问卷收集饮茶情况。二元logistic回归用于分析饮用绿茶与NAFLD新发和逆转的关系,根据性别、年龄及基线BMI水平进行了亚组分析,并逐一排除慢性疾病患者,如肥胖、腹型肥胖、高血压、高胆固醇血症、糖尿病和代谢综合征,进行敏感性分析。此外,采用广义估计方程分析绿茶摄入与AST/ALT 比值、FIB-4指数变化率的关系。结果在四年的随访过程中共有371例NAFLD新发病例。调整混杂因素后,绿茶摄入与NAFLD的发病风险及逆转率无显著关联。但是分别在女性（均值-0.022;95%CI:-0.038,-0.006,P=0.006）、50 岁及以下人群（均值-0.027;95%CI:-0.037,-0.016;P＜0.001）及 NAFLD 患者（均值-0.028;95%CI:-0.040,-0.016;P＜0.001）三个亚组中,发现饮用绿茶与AST/ALT 比值下降率增加有关。敏感性分析结果未显著改变。结论绿茶摄入与非酒精性肝损伤的关联存在显著种族差异,仅发现中国苏州地区人群和亚裔美国人饮用绿茶与非酒精性肝损伤风险降低有关。其次,绿茶摄入与肝病患者肝损伤减轻相关,与非肝病患者则无显著关联。第三部分:绿茶摄入与非酒精性肝损伤的作用机制:铁代谢的作用研究目的利用NHANES数据分析铁代谢指标与肝损伤、绿茶摄入与铁代谢指标的关联,并从铁代谢的角度探讨EGCG对CCl4导的小鼠肝损伤的防护作用及机制。1.铁代谢指标与肝损伤及绿茶摄入的流行病学关联材料与方法从NHANES中筛选符合纳入标准的参与者,采用加权多变量logistic回归模型分析血清铁、铁蛋白与非酒精性肝损伤的关联,以及饮用绿茶与低血清铁/铁过载的关联,并根据种族进行亚组分析。采用倾向性评分匹配方法对饮用绿茶和不饮茶者进行1:1匹配,然后采用线性回归分析饮用绿茶与血清铁的关联。结果调整混杂因素后,男性血清铁与NAFLD、晚期肝纤维化（Advanced hepatic fibrosis,AHF）风险均无显著关联,女性血清铁与NAFLD（Q4 vs.Q1:OR=0.48,95%CI:0.38-0.60,P-trend＜0.001）、AHF（Q4 vs.Q1:OR=0.59,95%CI:0.34-1.00,P=0.011）患病风险均呈显著负相关。男性（Q4 vs.Q1:OR=1.92,95%CI:1.27-2.89,P-trend＜0.001）和女性（Q4 vs.Q1:OR=2.29,95%CI:1.69-3.10,P-trend＜0.001）血清铁蛋白均与NAFLD患病风险呈显著正相关,而与AHF风险无显著关联。根据种族进行亚组分析发现,非西班牙裔黑人男性和非西班牙裔白人女性血清铁与NAFLD患病风险降低显著相关。非西班牙裔白人女性血清铁与AHF患病风险显著负相关（P=0.019）,非西班牙裔黑人男性血清铁蛋白与AHF显著正相关（P＜0.001）。仅在非西班牙裔白人中发现饮用绿茶与低血清铁患病风险显著正相关（OR=1.74,95%CI:1.00-3.02,P=0.049）,未发现饮用绿茶与铁过载的显著关联。在倾向性评分匹配成功的样本中,饮用绿茶与血清铁浓度呈显著负相关（β:16.49,95%CI:-19.98 to-13.00,P＜0.001）,但是该结论不适用于女性及20岁以下参与者。2.EGCG对小鼠肝损伤的防护作用及机制材料与方法C57BL/6雄性小鼠随机分为阴性对照组、CCl4组、CCl4+水飞蓟素（Sily）阳性对照组和CCl4+EGCG组。CCl4、CCl4+Sily和CCl4+EGCG组小鼠每周两次腹腔注射CCl4橄榄油溶液进行肝损伤造模,全部小鼠每周5次采用灌胃的方式给予双蒸水、Sily或EGCG。50天后处死小鼠,收集空腹静脉血、肝脏、空肠组织及肠道内容物进行相关分析。结果与对照组相比,CCl4组小鼠肝组织炎症、纤维化标志物（Ⅰ型、前Ⅲ型和Ⅳ型胶原、α-SMA）均显著升高,同时肝组织总铁、储铁蛋白、转铁蛋白受体的表达量也显著上调,空肠组织中携带铁离子转入细胞的转运蛋白Dmt1基因的转录水平以及相应的Tfr1基因的转录水平显著降低,而携带铁离子转出细胞的转运蛋白FPN1转录水平有明显升高的趋势。EGCG干预改善了组织病理学特征、显著降低了Ⅰ型和Ⅳ型胶原、α-SMA及IL-6水平,储铁蛋白和转铁蛋白的表达量也显著下调,逆转了空肠组织中Dmt1、Tfr1基因的转录水平的改变。此外,CCl4组小鼠肠道梭状芽胞杆菌属（Clostridiales）、优杆菌属（Eubacterium）显著降低,巴布芽胞杆菌（Ruminiclostridium）显著升高。EGCG干预则逆转了上述菌属的改变。结论机体铁蓄积伴随着非酒精性肝损伤风险升高,而绿茶饮用者往往具有较低的铁水平;EGCG通过减少肠道铁吸收、降低肝铁蓄积并调节肠道菌群结构发挥肝脏防护作用。