薇甘菊是菊科的一种藤本植物，被列为世界上最具入侵力的100种外来物种之一。近二十年来，薇甘菊入侵华南地区，并对华南地区的生态系统造成严重的破坏。近年来，在华南地区，用野菟丝子寄生对薇甘菊的生物量积累，生理和生态方面的影响效应研究表明，田野菟丝子可作为一种控制薇甘菊的有效的方法。为了研究田野菟丝子寄生对薇甘菊的生理生化和基因表达的影响机理，本论文对此问题进行了初步探讨。结果如下： (一)温室盆栽实验研究表明： (1)在田野菟丝子寄生薇甘菊的9-18天内，过氧化氢酶(CAT)活性极显著(p<0.01)高于对照，随后在27-36天内，降至对照水平；在田野菟丝子寄生薇甘菊的9-18天内，过氧化物酶(POD)活性显著(p<0.05)高于对照，但在27-36天时，降至对照水平甚至还低于对照；在田野菟丝子寄生薇甘菊的9-27天内，抗坏血酸氧化酶(APX)活性极显著(p<0.01)高于对照，但在36天时，降至对照水平；在田野菟丝子寄生薇甘菊的9-36天内，超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著(p<0.05)高于对照。 (2)在田野菟丝子寄生薇甘菊的9-36天内，薇甘菊叶片中MDA含量随寄生时间的延长增多，并且极显著(p<0.01)。 (3)田野菟丝子寄生能促进薇甘菊叶中可溶性糖的积累，减少薇甘菊叶片中可溶性蛋白含量。田野菟丝子寄生使薇甘菊叶中的总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b含量显著下降，并且随着寄生时间的延长，下降更为明显。随着田野菟丝子寄生时间的延长，极显著的抑制了Rubisco羧化酶和GO酶的活性。 (4)田野菟丝子在寄生薇甘菊的36天内，薇甘菊叶的净光合速率(Pn)，气孔导度(Gs)，蒸腾速率(Tr)和瞬时水分利用效率(WUE)都比对照降低，在36天时，薇甘菊叶的Pn，Gs和WUE都极显著降低。 (5)透射电镜表明，田野菟丝子寄生18天后的薇甘菊叶片的叶绿体形状异常；叶绿体肿胀变圆：叶绿体中嗜锇颗粒变多变大，淀粉粒的积累比对照明显增多而且体积增大；病变的叶绿体呈现小空泡；严重的导致叶绿体从细胞膜脱落，叶绿体膜破裂和叶绿体解体。 (二)构建了两个正向削减文库，共筛选到303个薇甘菊的EST。这些EST编码各种不同功能的蛋白，如新陈代谢、细胞防御与胁迫反应、转录因子、信号转导、运输和光合作用，其中一些基因也与其它报道的寄主植物的表达上升的基因有同源性。在薇甘菊的顶芽和茎中，均发现一些与细胞防御和细胞壁修复相关的基因，但是顶芽和茎中的基因表达模式是不同的。此外，薇甘菊顶芽中16.29％的ESTs和薇甘菊茎中17.60％的EST在NCBI数据库中匹配到未知功能。另外，相对定量PCR检测了21个随机选取的ESTs在寄生的薇甘菊中的表达水平，与对照相比，其中13个基因的表达量显著上升。这些结果表明，薇甘菊对田野菟丝子寄生的分子响应是一个相当复杂的过程。同时可看出，SSH文库测序结合定量PCR可以成功的用来检测田野菟丝子寄生诱导的薇甘菊基因。总之，本实验构建的削减文库所获得的相关基因，提供了田野菟丝子寄生对薇甘菊基因表达影响的总的响应情况，同时这些基因片段为以后深入研究薇甘菊与田野菟丝子的相互作用打下了较好的基础。此外，削减文库中也检测到75个与植物单链RNA病毒基因同源性较高的序列，这些发现为田野菟丝子与薇甘菊互作提供了新的研究视角，即薇甘菊—田野菟丝子—植物RNA病毒之间复杂的相互作用关系。 (三)利用cDNA末端快速扩增(RACE)和重叠延伸相结合的方法，从田野菟丝子寄生的薇甘菊SSH文库中克隆了一个全长几丁质酶基因的cDNA和两个NAC基因的cDNAs，并对其进行了基因功能方面的初步研究。 (1)根据薇甘菊顶芽的削减文库中的一个与几丁质酶基因有很高同源性的基因片段序列，设计基因特异引物，采用RACE方法克隆了一个全长几丁质酶基因(Mmchil基因)，并对其进行了生物信息学分析。Mmchil基因(GenBank登录号EU716625)的cDNA全长1295 bp，有957 bp的开放阅读框，预测编码318个氨基酸，有51 bp的5’—UTR(非编码区)和287 bp的3’—UTR，预算编码产物的分子量(Mw)为35.42 kDa，等电点(pI)为5.69。Mmchil基因的DNA序列含有两个内含子，长度分别为1171 bp和621 bp。Southern杂交结果表明，Mmchil基因在薇甘菊基因组中是一个低拷贝基因家族的成员。RT—PCR分析表明，Mmchil基因在所检测的组织器官中是特异性表达的。Mmchil基因在薇甘菊的顶芽中的表达，受田野菟丝子寄生及其它非生物因子的诱导。此外，我们构建了原核表达质粒pET—32a—Mmchil，将其转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株，通过IPTG诱导，经SDS—PAGE分析表明，重组蛋白主要以包涵体形式出现，相对分子量为55 kDa。我们尝试用不同的表达载体、降低诱导温度、调节渗透压和改变表达的宿主菌等方法。最后，我们将表达质粒pET—32a—Mmchil转入Rasotta—gamiTM(DE3)大肠杆菌菌株，成功地将目的蛋白在细胞质中进行了表达，最佳诱导温度和时间分别是25℃和4 h。目的重组蛋白经His—Bind kit试剂盒纯化，并且纯化的重组蛋白的最佳pH和最佳温度活性分别为pH5.5-6.5和35-40℃。 (2)从田野菟丝子寄生的薇甘菊的茎的削减文库中，通过RACE的方法克隆了两个NAC基因，分别命名为MmATAF1和MmNAP。核酸序列信息表明，MmATAF1和MmNAP基因都含有2个内含子和3个外显子，并且它们的基因组结构都非常保守。这两个基因的接合位点是通过基因组序列和其对应的cDNA序列分析比较得来的。MmATAF1和MmNAP基因编码的蛋白序列都含有一个引人注目的N末端保守结构域和一个高度多交的C端结构。基于系统进化的分析，MmATAF1和MmNAP蛋白分别归于不同功能的ATAF和NAP亚类。半定量RT—PCR分析表明，MmATAF1和MmNAP基因在检测的组织里表现不同的表达模式。MmATAF1基因在所有检测的组织里都有表达，但是表达的丰度不同。MmNAP基因在茎，叶柄，顶芽和叶中都衡量表达，但在根中不表达。此外，相对定量PCR分析表明，MmATAF1和MmNAP基因在薇甘菊的茎中的表达被田野菟丝子寄生所诱导。另外，MmATAF1和MmNAP基因在薇甘菊的顶芽中的表达也被机械损伤，ZnSO4.脱落酸(ABA)和水杨酸(SA)所诱导。将MmATAF1和MmNAP基因与表达载体pET—32a(+)连接构建融合表达载体，并在E.coli菌株BL21中进行了原核表达，SDS—PAGE分析表明，IPTG诱导产生带有His标签的融合蛋白His—MmATAF1和His—MmNAP的分子量(Mr)分别约为49 kDa和52 kDa。 本论文的田野菟丝子寄生对薇甘菊的生理生化的影响、田野菟丝子寄生薇甘菊诱导的SSH文库的构建、克隆cDNA全长及其基因功能方面的研究取得了初步结果，发现了大量的薇甘菊基因，为进一步研究其基因结构和时空表达特性及其生物学功能奠定了基础。本论文的创新点为：(1)首次在国际上研究了薇甘菊的顶芽和茎中差异表达的基因对田野菟丝子寄生早期的分子响应机制。(2)首次发现了MmATAF1和MmNAP基因被田野菟丝子寄生诱导表达。