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雄配子体的发育是植物生殖过程中的一个关键步骤。在开花的高等植物中,雄配子体的发育起始于单倍体的小孢子,小孢子在孢子体基因和配子体基因共同起作用下,经过两次有丝分裂发育成花粉粒。该发育过程是众多基因参与的一系列细胞分化的体现。虽然近十年来雄配子体的发育研究取得一定的进展,但迄今为止被证实与花粉发育相关的基因并不多,雄配子体发育的遗传机制还有许多有待于发现和理解。AtDUO1(DUO POLLENl)、AtDUO3(DUO POLLEN3)是在拟南芥中发现的影响雄性生殖细胞分裂和分化的两个调控因子,AtDUO1编码一个新的R2R3类MYB转录因子,含有2个SANT结构域,在雄性生殖细胞特异表达。AtDUO3是GONADLESS-4(GON-4)的同源基因,它编码的蛋白在C端具有一个非常保守的SANT结构域,是蛋白或DNA的结合区,AtDUO3在拟南芥的整个发育时期和各个组织中组成型表达,不但影响雄配子体的发育,也影响孢子体和雌配子体发育。
水稻是重要的粮食作物,水稻基因功能的研究受到了越来越多的生物学家的关注,探讨单子叶模式植物水稻同源基因DUO1、DUO3的功能,并对水稻同源基因DUO1、DUO3进行表达模式的研究,对比分析DUO1、DUO3在单双子叶模式植物的功能及表达模式的异同点,以期揭示DUO1、DUO3在植物中的进化方式,进而比较单双子叶植物之间的进化关系。
通过生物信息学分析OsDUO1和AtDUO1的氨基酸序列相似性达到80%以上,且都含有两个SANT结构域;AtDUO3含有一个SANT结构域,OsDUO3含有两个SANT结构域,AtDUO3和OsDUO3的第一个SANT结构域的氨基酸序列相似性大约为75%。所以从蛋白结构上,DUO1、DUO3基因在水稻和拟南芥中是比较保守的。
RT-PCR分析结果表明OsDUO1、OsDUO3分别与已经报道的AtDUO1、AtDUO3表达模式类似,OsDUO1只在水稻的成熟花药中表达,OsDUO3在水稻中组成型表达。为了进一步验证DUO1和DUO3基因表达在进化上的保守性,我们分别构建OsDUO1、OsDUO3启动子融合报告基因GUS、eGFP的载体,并用农杆菌介导的方法分别转化野生型水稻,获得了抗性转基因苗。
为了进一步分析AtDUO1、AtDUO3基因在水稻中表达模式及OsDUO1、OsDUO3在拟南芥中的表达模式,我们分别构建AtDUO1、AtDUO3启动子融合报告基因eGFP的载体,用农杆菌介导的方法转化野生型水稻,目前已获得抗性转基因苗。为进一步分析DUO1、DUO3基因在水稻和拟南芥中的功能上的保守性,我们克隆OsDUO1、OsDUO3基因的cDNA,将它们分别和AtDUO1、AtDUO3基因的启动子融合,拟转atduol、atduo3突变体,观察是否能互补突变体的表型,这些对于研究DUO1、DUO3在水稻和拟南芥的功能和进化关系具有一定的意义。
本课题主要以单子叶模式植物水稻为研究对象,利用DUO1、DUO3在水稻和拟南芥的同源性可以比较单双子叶植物之间的进化关系,为更好的理解物种的进化提供证据。同时本论文的这些研究将有助于拓展人们对于植物雄配子体发育乃至花药发育分子机理的认识,这对于我们研究植物的雄性不育以及生殖发育具有一定的意义,将为进一步利用作物杂种优势方法来提高作物产量打下基础。