目的：糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常见的微血管并发症,它不仅是慢性肾功能衰竭患者肾移植的主要原因,还能大幅增加糖尿病患者心血管疾病的死亡率。肾小球硬化是1型与2型DN共同的特征性肾脏病理改变。DN发病机制非常复杂,涉及氧化应激、多元醇通路激活、糖基化终末产物沉积、血流动力学改变及诸多细胞因子异常等因素,为了深入揭示DN肾小球硬化的病理机制,本研究采用蛋白质组学技术,以体内与体外实验相结合,通过自发型2型DN模型OLETF大鼠肾皮质胞浆和胞膜亚差异蛋白质组学研究和高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞动态差异蛋白质组学研究,探讨DN时肾小球硬化发病过程中蛋白质组学变化规律,以期更加深入理解DN肾小球硬化的发生机理。方法：1.自发型2型DN模型OLETF大鼠差异蛋白质组学研究OLETF大鼠和遗传背景相似但不发病的LETO大鼠各7只用于本实验。实验中OLETF大鼠血糖及尿蛋白排泄呈渐进性升高,出现肾小球硬化及间质纤维化等类似于人类2型DN的肾脏病理改变。动物在36周龄时处死取材,分离肾皮质,分别提取胞浆和胞膜总蛋白。获得的蛋白样品经双向电泳分离,胶体考马斯亮蓝染色显示。扫描输入计算机,用图像分析软件ImageMaster 6.0对凝胶进行分析,差异蛋白判定标准为：该蛋白点在LETO和OLETF两组间有统计学差异(两组蛋白点的volume%先经方差不齐t检验获得p,后经FDR校正后p<0.05),且volume%值变化超过2倍。将凝胶中的差异蛋白点切出,经胶内胰蛋白酶解和MALDI-TOF-MS获得肽质量指纹谱并进行Mascot对蛋白质进行分析。利用GoMinerTM、BINGO软件对差异蛋白质进行Gene Ontology(GO)分类和过度表达分析。对发现磷酸修饰的蛋白进行进一步的同源性和磷酸化位点保守性分析。2.高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞动态差异蛋白质组学研究原代分离培养并传至第5代的大鼠肾小球系膜细胞分别置含5.5mM(正常对照组,NC组)和30mM葡萄糖(高糖组,HG组)培养基中,分别培养0h、8h、16h、72h、25day,提取细胞总蛋白。蛋白样品经双向电泳技术分离,胶体考马斯亮蓝显示,差异蛋白分析、判定,利用MALDI-TOF-MS获得肽指纹图谱进行蛋白鉴定,对凝胶上多个蛋白点代表同一种蛋白质的肽指纹图谱进行磷酸化修饰分析,对差异蛋白进行GO功能分类及过度表达分析。从IntAct Web Service Clien获取差异蛋白质的相互作用网路,用Cytoscape显示,并用MCODE分析。结果：1.描述了36周龄OLETF和LETO大鼠肾皮质胞浆和胞膜蛋白的差异蛋白质组学变化。与LETO大鼠相比OLETF大鼠肾皮质胞浆蛋白中9个蛋白点(Gapdh, Qdpr, Fah, similar to Protein C14orf159 mitochondrial precursor, Ephx2, Alb, Acadsb, Clybl)下调,8个蛋白点(Qdpr, Ephx2, Fthfd, Tf, Naprtl, Idh1, Fah, Cryab)上调。胞膜蛋白中11个蛋白点(Uqcrfsl, Nrnll, Pbld, LOC683519, Calbl, Acadsb, Dmgdh, Etfb)下调,10个蛋白点(LOC683519, Qdpr, GMPK, Etfb, Uqcrfsl, Fah, Dmgdh, Gpx3, cytokeratin 8 polypeptide)上调。这些差异蛋白主要定位在胞浆、线粒体和细胞小泡。能够和离子、维生素、蛋白结合,其分子功能主要和氧化还原活性、电子传递、转运、抗氧化有关,主要参与细胞信号传导、细胞凋亡、应激反应和芳香族氨基酸、氧和活性氧代谢过程。其参与的生物学过程包括氧化还原、羧酸代谢、一元羧酸代谢、急性炎症反应、应激反应、脂肪酸代谢过度表达等。研究中发现多个不同的点代表相同的蛋白质,提示不同的转录版本或不同的翻译后修饰在DN发病过程中有重要作用。初步判断Qdpr, Ephx2、LOC683519、GMPK在DN发病过程中发生了磷酸化修饰的改变。Ephx2同源性较高,Thr-50、Thr-59、Ser-70在人、小鼠、大鼠中保守性较高。2.描述了高糖环境对肾小球系膜细胞影响的蛋白质组学动态变化。细胞蛋白质组学结果分析发现28个差异蛋白点,其中在8h和16h2个蛋白点表达上调(Rcn2, Hspb1),24个蛋白点(Tcpl, Wdrl, Cct2, Eno1, Adss, Eef1g, Idhl, Pcbpl, Akrlbl, rCG53488, Pgam1, Psma6, Psmb7, Prdx6, Gstpl, Stmn1, Sodl, Krt2-7, Hmgb1, Serpinb9)表达下调,72小时2个蛋白点(Psma6, Hmgbl)表达下调,25天有2个蛋白点(Pdia3, Idh3a)表达上调。差异表达的蛋白主要定位在胞浆、胞核、细胞骨架、线粒体和内质网上,能与蛋白、核酸、离子结合,其分子功能以抗氧化活性、氧化还原活性、水解酶活性、异构酶活性为主；并参与细胞信号、细胞周期、凋亡、细胞增殖、细胞碳水化合物代谢、DNA代谢、RNA代谢、蛋白质代谢、氧和活性氧代谢等多种生物过程。GO过度表达和蛋白相互作用分析发现差异蛋白不仅和已知在DN发病中起到重要作用的糖代谢、氧化应激、分子伴侣有关,还和蛋白酶体相关的蛋白降解过程密切相关。结论：1.本研究结果发现与基因背景类似的正常LETO大鼠相比糖尿病肾病大鼠OLETF大鼠中Qdpr、Ephx2、Fah、Fthfd、p55 protein等蛋白表达丰度或磷酸化修饰的改变,尤其是发现体内有着重要功能的Ephx2存在磷酸化修饰,且在糖尿病肾病下发生了磷酸化修饰的改变。提示在DN肾小球硬化过程中,许多蛋白不仅存在丰度变化,还存在转录后修饰变化。这些发现为DN肾小球硬化机理研究提供新的思路。2.本研究结果发现高糖环境下系膜细胞PCBP1、HMGB1、Psma6、Psmb7、Prdx6、Rcn2、Serpinb9等蛋白表达丰度发生了动态改变。通过信息生物学研究发现除了已知的通路外,蛋白酶体通路也发生了改变,提示该通路与高糖环境下的肾小球系膜细胞增殖、肥大有着重要作用。这些发现可能为DN肾小球硬化机制研究提供新的思路。