猪链球菌(Streptococcus suis, SS)是猪的重要致病菌,可以引起脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎、肺炎等疾病,也可导致生猪从业人员感染和死亡。根据其荚膜抗原的不同,猪链球菌分为33个血清型(1-31,33,1/2),其中猪链球菌2型(SS2)流行最广,分离率最高,可以通过直接接触传染人。细菌生物被膜是细菌为适应自‘然环境、有利于生存而特有的生命现象,当细菌吸附于活组织或无活力的组织表面,分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖蛋白复合物,使细菌相互粘连并将其自身克隆聚集缠绕其中形成的膜样物。在自然环境中有大量的细菌是以生物被膜形式存在,不同于实验室研究的浮游态的细菌。生物被膜在细菌的致病性上起着非常重要的作用。目前的研究集中在猪链球菌形成的生物被膜增加了对宿主的抵抗力及耐药性增加方面。然而毒力和生物被膜形成能力的相互关系以及生物被膜状态下细菌各种生物学特性的差异研究甚少。本研究首次建立猪链球菌体内体外生物被膜模型,比较了生物被膜状态下与浮游态细菌在粘附、毒力、基因表达和蛋白表达之间的差异,并通过蛋白结晶和基因缺失系统研究了密度感应系统(LuxS蛋白)的结构及对生物被膜的影响研究。1猪链球菌体内体外生物被膜模型的建立和结构观察猪链球菌可粘附于细胞外的基质蛋白,可能使猪产生生物被膜状态的感染。利用96孔微板法在体外建立了生物被膜模型,用激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察到猪链球菌在体外能够形成生物被膜并观察到生物被膜的形态。首次利用斑马鱼模型建立了猪链球菌体内生物被膜感染的模型,采用光镜和扫描电镜观察,发现猪链球菌在斑马鱼体内呈细菌聚集趋势,发现了类似于“生物被膜”样的细菌集簇。为进一步研究猪链球菌的感染机制及致病机理奠定了基础。2猪链球菌生物被膜和浮游态生物学特性比较研究猪链球菌2型(SS2)可以在恶劣的环境中存在而形成生物被膜。实验发现强毒株ZY05719和HA9801形成生物被膜能力强于无毒株T15。比较了生物被膜状态下与浮游态的细菌粘附HEp-2细胞的能力、毒力、毒力基因的表达差异,结果发现与浮游态相比粘附率下降了58%,半数致死量(LD50)增加了40倍。荧光定量PCR发现生物被膜状态细胞与浮游态细胞相比gdh、cps2和mrp基因表达下调,而sly和gapdh表达上调。生物被膜和浮游态下灭活疫苗保护率分别为60%和46%。这一结果提示,细菌致病力和形成生物被膜的能力之间可能存在一定的联系;细胞粘附、基因表达水平和毒力在生物被膜细胞和浮游细胞之间有较大差异。提示强毒株可能通过形成生物被膜而减弱其毒力,从而达到在宿主体内持续性感染的目的。3生物被膜和浮游生长状态的猪链球菌比较/免疫蛋白质组学分析猪链球菌2型(SS2)能够在体外形成生物被膜。利用比较蛋白组学和免疫蛋白组学方法,研究了SS2生物被膜状态与浮游态下细菌总蛋白以及免疫原性蛋白表达的差异。结果表明,生物被膜状态下6个蛋白表达上调,7个蛋白表达下调。采用猪链球菌康复血清,与生物被膜状态下细菌的总蛋白进行免疫蛋白组学分析,发现有9种蛋白具有免疫原性,其中5个蛋白首次在猪链球菌中报道具有免疫原性,其余4个蛋白在生物被膜状态和浮游状态下均被鉴定具有免疫原性。这些结果表明细菌生物被膜状态下与浮游态相比,有着不同的蛋白表达,所鉴定的新免疫原性的蛋白可作为防治生物被膜感染的疫苗侯选抗原,特别是4种在两种状态都被鉴定的共同抗原可能有效的防止生物被膜和急性感染。4猪链球菌S-核糖基高半胱氨酸酶的表达、晶体结构和功能S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS)是S-腺苷甲硫氨酸代谢途径中的重要的一种酶,它可代谢产生细菌密度感应系统中的信号分子AI-2。以猪链球菌2型S-核糖基高半胱氨酸酶为研究对象,利用基因重组技术在大肠杆菌中表达获得大量LuxS蛋白,通过对LuxS进行结晶筛选和优化获得质量较好的晶体；对蛋白晶体进行X射线衍射实验,获得x射线衍射数据；通过数据分析解析了其三维精细结构,通过电感耦合等离子体质谱方法确定链球菌s-核糖基高半胱氨酸酶中含二价金属离子锌。在此结构的基础上对LuxS作为猪链球菌2型区别于其他细菌的结构特点进行了讨论,揭示该酶可能的进化机制,为防控猪链球菌的药物设计提供理论基础。5猪链球菌2型HA9801luxS基因缺失株的构建及其特性已报道猪链球菌2型(SS2)的luxS在调控各种行为及种间信号中起着非常重要的作用,然而luxS基因在SS2中的作用还不清楚。利用同源重组原理构建了SS2的luxS缺失株和互补株,并比较了各菌株在细胞粘附、溶血性、形成生物被膜能力、毒力及毒力基因表达中的差异。结果表明所有检测的SS2都含有luxS基因,缺失株的溶血性和生物被膜的能力有显著的降低,粘附HEp-2细胞的能力降低了51%,7个毒力基因表达有不同程度的下调,在斑马鱼的感染模型中,LD50下降了10倍,揭示了其毒力下降。结果提示luxS基因对SS2有多重效应,推测可能取决于干扰了细菌的信号交流。