数码显微镜镜头的齐焦性检测中，需要对图像的清晰度进行判定和比较，然而图像清晰度的判定结果受光照因素影响很大，导致检测结果不稳定，因此需要研究对光照具有较强鲁棒性的图像清晰度判定方法。本文在对目前常用的图像清晰度判定方法进行分析比较的基础上，针对数码显微图像清晰度判定方法中的光照影响，设计了三种对光照具有较强鲁棒性的图像清晰度判定方法。局部归一化是一种常用的光照处理方法，本文用它对图像进行处理，消除光照对图像的影响，得到一幅对光照不敏感的归一化图像，再用目前常用图像清晰度判定方法对其清晰度进行判定。实验证明，该方法对光照具有一定的鲁棒性，其稳定度平均提高了76.05%，最高能达到了90.22%。图像的纹理是判定图像清晰度的一个重要指标。本文采用对纹理特征具有卓越描绘能力的局部二进制模式，对图像进行纹理特征提取，并根据二进制数连接方式的不固定性，针对不同的目标图像采用不同的连接方式，得到最佳的LBP图像，最后对LBP图像进行清晰度判定。实验证明，通过纹理特征能很好的判定光照不一致图像的清晰度，稳定度平均能提高83.89%，最高可达到99.90%。光照不均匀是一种常见的光照问题，我们把对图像具有增强效果的定向局部直方图均衡化方法引入到图像清晰度判定方法中来，结合其所具有的边缘方向信息，针对不同的区域采用不同的边缘方向，以此来获取最佳的增强图像，最后判定图像的清晰度。经多种方法测试，该方法对光照具有较好的鲁棒性，稳定度平均能提高87.66%，最高可达到99.28%。