研究背景与目的:免疫系统是机体识别、清除外源性有害物质与保护机体自身、维持体内稳态的重要系统。根据免疫反应的特异性,免疫系统被分成先天性免疫系统与适应性免疫系统两大分支。先天性免疫系统来自于机体自身所具有的免疫功能。先天性免疫系统包括机体的物理屏障、生物体内的生物活性分子和先天性免疫细胞。先天性免疫系统能够对于入侵的病原体微生物、机体损伤释放产物、异常状态的细胞产生免疫反应,达到防御感染与维持机体稳态的效果。适应性免疫系统依赖于后天机体免疫系统发展而来。适应性免疫系统主要包括抗原提呈细胞和T、B淋巴细胞。适应性免疫反应涉及抗原提呈细胞和T、B淋巴细胞之间严格调节的相互作用,通过基因片段重排产生具有特定抗原受体的T、B淋巴细胞,产生抗原特异性的免疫反应。免疫系统功能失调与多种疾病的发生与发展密切相关,调节免疫系统功能能够取得治疗作用。在器官移植中,器官移植受体免疫系统对于移植器官的识别与攻击会导致移植物的功能受损,并最终导致移植物被排斥,完全丧失功能。针对移植器官的免疫排斥反应是受体免疫系统识别供体来源的抗原,激活先天性免疫系统和适应性免疫系统而产生的急性和慢性排斥反应。另一类与免疫系统密切相关的疾病类型是自身免疫性疾病。自身免疫性疾病是一种免疫系统针对宿主自身细胞、组织和器官产生慢性免疫反应,最终导致组织结构破坏、功能障碍和病理性改变的疾病。自身免疫反应导致机体组织损伤的机制与移植免疫排斥类似,都是机体免疫系统对自身抗原产生过度免疫反应后,免疫系统攻击表达自身抗原的正常组织细胞,导致组织结构破坏,功能异常。移植免疫排斥和自身免疫性疾病的治疗的关键是抑制免疫反应,诱导免疫耐受。虽然当前的免疫抑制策略在移植免疫排斥与自身免疫性疾病的治疗中取得了一定的效果,但是仍然存在许多毒副作用与应用局限性。因此,开发新的诱导免疫耐受的策略对于移植免疫排斥与自身免疫性疾病的治疗极为重要。纳米医学是将纳米技术应用于医学领域,赋予药物独特的生物学效应,提高疾病的预防、诊断、治疗和康复效果的一门新兴的科学技术。纳米药物能够通过将药物分子吸附于材料表面或包裹于材料内部等方式,高效地运载各种药物分子,将药物分子靶向递送至特定部位,实现高效递送药物分子的目的。与传统药物相比,纳米药物递送系统具有许多独特的优势,例如提高药物利用率与稳定性、提高药物靶向性、降低毒副作用等。纳米药物的发展为调节免疫反应、抑制移植免疫排斥和治疗自身免疫性疾病提供了许多新策略,具有广泛的应用前景。本研究的目的是探索利用纳米颗粒作为药物递送载体诱导免疫耐受用于治疗移植免疫排斥和自身免疫性疾病。利用纳米药物载体,靶向多器官组织中DC和巨噬细胞递送CD40 siRNA,抑制DC和巨噬细胞的分化和活化,从而抑制移植受体体内免疫排斥反应,延长移植物的存活时间;靶向心脏组织递送免疫抑制剂（tacrolimus）,增强在靶器官局部微环境的免疫抑制性,抑制心脏组织浸润T细胞的活化,提高自身免疫性疾病的治疗效果。我们通过基于纳米药物载体的不同药物递送策略,研究调控全身抗原提呈细胞功能和组织局部T细胞活化的作用,探究抑制免疫反应治疗免疫相关疾病的效果与机制。研究方法:首先,我们通过双乳化法制备包载CD40 siRNA的载药纳米颗粒（siCD40/NPs）,利用粒度仪对siCD40/NPs进行表征。通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜对尾静脉注射后siCD40/NPs在小鼠体内的分布进行分析。随后我们通过流式细胞术检测小鼠尾静脉注射siCD40/NPs后DC和巨噬细胞CD40的表达。我们进一步利用流式细胞术检测了siCD40/NPs在小鼠DC和巨噬细胞的前体细胞中的分布。随后我们利用流式细胞术和qPCR检测siCD40/NPs对于小鼠骨髓诱导DC和巨噬细胞的影响。我们利用编码CD40 shRNA的慢病毒载体验证降低CD40对于DC和巨噬细胞分化的影响。我们在小鼠同种异基因皮肤移植模型中验证了siCD40/NPs抑制移植免疫排斥反应,延长小鼠同种异基因皮肤移植物存活时间的效果。其次,我们通过薄膜水化法制备获得4种PEG末端修饰不同化学基团的脂质纳米颗粒（LNP-Met、LNP-Ami、LNP-Car、LNP-Mal）,利用粒度仪对LNP进行表征。我们通过扫描电子显微镜对LNP形貌进行了观察。在尾静脉注射DiD荧光标记的LNP后,我们通过小动物成像和激光共聚焦显微镜对LNP在小鼠心脏与其他主要脏器中的分布进行分析。我们进一步分析了尾静脉注射后不同时间点LNP-Mal和马来酰亚胺修饰比例不同的LNP-Mal在小鼠心脏中的分布。我们通过流式细胞术和激光共聚焦对LNP-Mal在小鼠心肌细胞中的分布。我们利用免疫荧光检测尾静脉注射LNP-Mal/mRFP后小鼠心肌组织中RFP的表达。我们在小鼠自身免疫性心肌炎模型中检测了LNP-Mal/Tac抑制小鼠自身免疫性心肌炎症反应,保护小鼠心肌组织的效果。我们进一步通过流式细胞术检测了LNPMal/Tac对于小鼠T细胞增殖的影响。研究结果:我们通过双乳化法制备获得了包载CD40 siRNA的siCD40/NPs。尾静脉注射后,siCD40/NPs能够将siRNA递送至小鼠DC和巨噬细胞中。siCD40/NPs能显著降低脾脏DC和巨噬细胞中CD40的表达,并显著降低脾脏中DC和巨噬细胞的比例和数量。我们进一步发现siCD40/NPs能够将siRNA递送至小鼠DC和巨噬细胞的造血干细胞和前体细胞中。小鼠骨髓诱导DC和巨噬细胞实验表明siCD40/NPs能够抑制DC和巨噬细胞的分化,并且抑制DC和巨噬细胞的活化。慢病毒载体验证结果表明,降低CD40的表达能够抑制DC和巨噬细胞的分化与成熟。在小鼠同种异基因皮肤移植模型中,siCD40/NPs能够抑制移植免疫排斥反应,显著延长小鼠同种异基因皮肤移植物存活时间。我们通过薄膜水化法制备获得了4种不同末端PEG修饰的LNP。在尾静脉注射后,LNP-Mal在小鼠心脏中的分布明显高于其他修饰的LNP。尾静脉给药后,虽然小动物成像结果显示给药后小鼠心脏荧光信号随时间逐渐减弱,但是CLSM观察结果表明小鼠心肌组织中DiD荧光信号随时间逐渐增强。随着马来酰亚胺修饰比例升高,,小鼠心肌组织中DiD荧光信号分布逐渐分散。尾静脉注射后LNP-Mal能够进入小鼠心肌组织中,并且能够被小鼠心肌细胞所摄取。LNPMal/mRFP能够将RFP mRNA递送至小鼠心肌细胞中并表达。在小鼠自身免疫性心肌炎模型中,LNP-Mal/Tac能够抑制小鼠自身免疫性心肌炎症反应,保护小鼠心肌组织,抑制小鼠心脏病理性扩张。LNP-Mal/Tac能够通过提高心肌组织中tacrolimus的浓度抑制心肌组织浸润T细胞的功能。研究结论:首先,我们的研究结果表明siCD40/NPs能够降低体内多器官中DC和巨噬细胞的CD40表达,同时能够沉默骨髓造血干细胞和髓系前体细胞中CD40表达,从而抑制了DC和巨噬细胞的分化与成熟。因此,静脉注射的siCD40/NPs能够高效降低抗原提呈细胞诱导T细胞活化的效果,从而增强移植受体的免疫耐受水平,延长小鼠同种异基因皮肤移植物的存活时间。进一步,我们发现PEG末端的马来酰亚胺修饰能够提高尾静脉注射的LNP在心脏中的富集。LNP-Mal分布于小鼠心肌细胞和细胞外基质中。因此,利用LNP-Mal能够向心肌细胞递送RFP mRNA并成功表达RFP蛋白。在低剂量tacrolimus水平下,LNP-Mal/Tac显著增强了心肌组织微环境的免疫抑制水平,有效抑制小鼠自身免疫性心肌炎炎症反应,保护小鼠心肌组织和心脏功能。我们的研究结果证明纳米药物载体能够通过调控全身免疫细胞功能和建立局部组织内免疫抑制微环境,实现抑制免疫反应、诱导免疫耐受的效果,为相关疾病的治疗提供了新策略和新方法。