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干扰素(Inferon,IFN)是生物体内一类具有抗病毒和抗肿瘤活性的糖蛋白。干扰素并不直接杀死病毒而是作为细胞外信号分子,将信号传递给细胞,通过激活细胞内一系类信号通路从而起到抑制病毒的作用。目前研究表明,有多个信号通路包括JAK-STAT(Janus Kinase-Signal transducer and activator of transcription)信号通路和RIG-Ⅰ(retinoi acid-inducible geneⅠ)信号通路等和干扰素信号密切相关。其中STAT1(Signal transducer and activator of transcription)和MAVS(Mitochondrial antiviral signaling protein)作为关键的信号分子,已被证明在高等脊椎动物抗病毒天然免疫中发挥着重要作用,但到目前为止,鱼类中关于STAT1和MAVS的相关研究甚少。 石斑鱼是一种重要经济养殖海水鱼类,然而近年来赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV(red-spotted grouper nervous necrosis virus)及新加坡虹彩病毒SGIV(Singapore grouper iridovirus)感染石斑鱼引起的疾病,每年给石斑鱼产业带来了巨大的损失。鉴于对石斑鱼免疫相关基因功能的研究,能帮助揭示石斑鱼宿主抵抗病毒感染的防御机制,为石斑鱼病毒病害的防治奠定基础,本论文首次克隆了石斑鱼EcSTAT1a和EcMAVS基因并对其功能进行研究,研究成果如下: 1.斜带石斑鱼STAT1a基因(EcSTAT1a)克隆与功能研究。EcSTAT1a编码751个氨基酸,与鳜鱼和黑带石斑鱼STAT1的同源性分别为97%和93%。通过氨基酸序列比对发现,EcSAT1a包含如下结构域:一个STAT-int结构域,一个STAT-alpha结构域,一个STAT-bind结构域(DNA结合结构域),一个SH2(Src homology2domain)结构域,一个STAT1-TAZ2结合结构域。STAT1a在健康石斑鱼的肠、鳃、肝中表达量最高。在赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)、新加坡虹彩病毒(SCIV)的分别刺激下,石斑鱼脾细胞(GS)中EcSTAT1a的相对表达量显著升高。亚细胞定位结果表明EcSTAT1a主要分布在细胞质中。体外过表达EcSTAT1a能显著延缓RGNNV和SGIV诱导的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)进程。进一步研究表明,过表达EcSTAT1a能显著抑制了SGIV的MCP、VP19、ICP18、LITAF基因以及RGNNV的CP和RdRp基因的表达,由此可以说明EcSTAT1a具有抗虹彩病毒和诺达病毒的活性。此外,过表达EcSTAT1a显著增加干扰素相关因子及炎症因子(IRF3,IRF7,ISG15,IFP35,Viperin,ISG56,IRF1,IRF2,MXI,TNFα,IL8和IL-1β)的表达水平。综上所述,我们的研究表明EcSTAT1a做为一种重要的抗病毒因子,可能是通过调节宿主的干扰素免疫和炎症反应起到抗病毒作用。 2.斜带石斑鱼MAVS基因(EcMAVS)克隆与功能研究。EcMAVS编码563个氨基酸,与石鲷鱼和人类MAVS的同源性分别为64%和20%。氨基酸序列比对发现,EcMAVS包含如下结构域:一个C端TM(transmembrane)结构域,一个N端CARD保守结构域,一个脯氨酸富集结构域。系统发育分析表明EcMAVS与石鲷鱼亲缘关系最近。通过检测发现EcMAVS在健康石斑鱼的鳃、肠和皮肤表达量最高。RGNNV体外感染GS细胞能显著增加EcMAVS的表达水平,然而SGIV的感染对EcMAVS的表达量几乎没有变化,表明EcMAVS针对不同的病毒可能发挥不同的作用。亚细胞定位结果表明,EcMAVS和线粒体共定位。过表达EcMAVS能显著抑制RGNNV病毒基因的复制,延缓病毒的CPE进程,然而对SGIV病毒的复制和CPE进程几乎没有影响。进一步研究表明,过表达EcMAVS能显著增加干扰素相关因子的表达,激活IRF3和IRF7介导的干扰素启动子活性。综上所述,研究结果表明,EcMAVS主要是通过上调干扰素免疫应答反应从而起到抗RGNNV病毒的作用。 上述结果表明,EcSTAT1a和EcMAVS具有很强的抗病毒功能。同时也表明,EcSTAT1a和EcMAVS主要是通过调节干扰素相关基因从而起到抗病毒作用。