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在动物生产及动物疾病防治中,经常发生不规范、超量使用抗生素的情况,诱使很多病原菌产生耐药性。“超级细菌”(多重耐药性的病原菌)的产生使细菌耐药问题变得更加复杂和严峻。细菌耐药性问题有愈演愈烈的趋势,已经严重威胁到公共卫生安全及人用抗生素资源。噬菌体裂解酶能高效、快速、特异地裂解耐药性病原菌,并且细菌对裂解酶不易产生耐受性。肽聚糖是细胞壁的骨架,裂解酶能催化肽聚糖,导致骨架断裂,细菌裂解。革兰氏阳性(G+)菌的肽聚糖在细胞壁的外层,裂解酶直接与之发生作用从而裂解细菌,因此针对G+菌噬菌体裂解酶制剂便于制备。但是,革兰氏阴性(G-)菌细胞壁外层是紧密的外膜蛋白,外膜蛋白仅允许小分子量的物质透过。阴性菌的肽聚糖在周质空间,因而裂解酶不能从菌外透过外膜接触肽聚糖裂解G-菌,阻碍了针对革兰氏阴性菌的裂解酶制剂的研发。本研究针对这一问题进行了研究,探索裂解酶透过G-菌外膜的方法,构建基因工程裂解酶从菌外杀灭大肠杆菌。对自然界中能透过G-菌外膜的大分子蛋白Colicin A、Lys AB2、SPN9CC、Lys PA26、D8进行生物信息学分析。将这5种已知蛋白的序列进行同源性分析、比对,发现它们的同源性不相关。因此推测,它们的跨膜功能与氨基酸序列无关。使用在线软件TMHMM分析它们跨膜区域的结构,使用在线软件Ex PASy对它们进行理化性质分析,利用在线软件SWISS-MODEL进行了同源模建、三级结构预测。发现这几种蛋白的共同点是,在某个区域或末端带正电荷数的氨基酸与疏水性氨基酸比例较高。因此推测在裂解酶末端修饰疏水性氨基酸、带正电荷氨基酸能帮助裂解酶透过G-菌细胞外膜。为了验证推测是否正确,进行了实验研究。首先对裂解酶C端修饰疏水性氨基酸单因素对其透过细胞外膜影响进行了研究。前期研究的噬菌体裂解酶Lysep3不能从菌外裂解大肠杆菌,以Lysep3为基础分别在它的C端修饰上不同疏水性氨基酸Ile、Val、Leu、Phe、Ala,构建了疏水指数分别为1.711、2.311、2.889、4.089、4.089的5种融合裂解酶Lysep3-3、Lysep3-5、Lysep3-7、Lysep3-12a、Lysep3-12b。其中Lysep3-12a、Lysep3-12b疏水指数相同,氨基酸序列不同。原核表达并纯化了这5种融合裂解酶。实验显示它们在p H=5和浓度1.75μg/m L时裂解细胞活性最强。Lysep3-12a、Lysep3-12b的裂解细胞能力相同,说明裂解酶的活性与氨基酸序列无关。研究表明,裂解酶C端的疏水性氨基酸,能帮助噬菌体裂解酶从菌外裂解大肠杆菌,且融合裂解酶裂解G-菌的能力与C端修饰的疏水性氨基酸的数量相关,修饰的数量越多其杀菌能力愈强。在Lysep3的C端修饰上KRKRK 5个阳离子氨基酸构建成融合裂解酶Lysep3-5aa,修饰KRKRKRKRKR 10个阳离子氨基酸构建成融合裂解酶Lysep3-10aa,同样的方法修饰KRKRKRKRKRKRKRK15个阳离子氨基酸构建成融合裂解酶Lysep3-15aa,它们的等电点分别为11.37、12.31、12.48。原核表达并纯化上述融合裂解酶,分别与大肠杆菌作用后,发现它们都有一定的杀菌能力,并且杀菌能力和C端修饰的带正电氨基酸数呈正相关。其中,融合裂解酶Lysep3-15aa杀菌活性较好,并能对沙门氏菌、志贺杆菌、绿脓杆菌有一定的杀菌能力。根据以上实验数据,在Lysep3 C端修饰一定数量的疏水性氨基酸、带正电氨基酸;为了增强其识别大肠杆菌的能力,在其N端与大肠杆菌素识别区BR进行融合修饰,构建而成Colicin-Lysep3。原核表达并纯化了Colicin-Lysep3。电镜下观察Colicin-Lysep3能使大肠杆菌细胞壁裂解,细胞内容物外泄,部分细胞形成菌影。Colicin-Lysep3在p H=5时杀菌性能最强。同时它也表现出肽类杀菌剂一般的特点,杀菌性能与剂量、时间有一定的关系。灌服Colicin-Lysep3的小鼠,在小肠前段目标大肠杆菌含量与对照组相比平均减少10.70%;小肠后段减少3.23%,盲肠减少2.63%。进一步研究表明,Colicin-Lysep3杀菌机制是:其识别区域与大肠杆菌进行结合后,在C端电荷及疏水性氨基酸帮助下,裂解酶透过外膜接触肽聚糖,对其乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1,4糖苷键发生催化反应,使之断裂,细胞壁骨架破裂,在胞内压力的作用下,细菌内容物外泄而死亡。直接将Colicin-Lysep3用于饲料添加剂,成本高昂。本研究采用无痕迹、二次同源重组的方法,将分离的一株抗逆性好的枯草芽孢杆菌的Spo0 A基因替换成Colicin-Lysep3基因,构建工程菌株△B.subtilis。△B.subtilis表达Colicin-Lysep3,并将其分泌到菌外,△B.subtilis具有体内外杀灭大肠杆菌的功能。综上,在大肠杆菌噬菌体裂解酶C端修饰疏水性氨基酸,带电荷氨基酸,能帮助其从菌外裂解G-菌;在一定范围内,末端添加的疏水性氨基酸、带电荷氨基酸的数量与其透过外膜的能力成正比例。为制备从菌外裂解G-菌基因工程噬菌体融合裂解酶提供了理论基础。