家蚕茧中的色素来自桑叶,经蚕食下后,由中肠上皮细胞吸收,通过中肠进入血淋巴,最后进入丝腺,在丝胶层积累,使茧丝着色。由于茧丝中色素的种类,含量和分布的不同,产生了各种茧色。家蚕黄红茧系形成主要色素为类胡萝卜素,包括叶黄素,β-胡萝卜素,α-胡萝卜素和紫黄质。对黄红茧系中茧色形成研究比较深入的是黄茧形成机理,黄茧中主要色素是叶黄素,其次是β-胡萝卜素,涉及Y,I,C三个基因的调控。Y基因为黄血基因,控制中肠上皮细胞对类胡萝卜素的吸收,可使血液着色;I基因为黄血抑制基因,控制类胡萝卜素由中肠到血液的转运;C基因控制类胡萝卜素由血液进入丝腺,使丝腺着色。Y,I,C分别对+Y,+I,+C为显性。只有Y+IC的基因组合才能形成黄色茧,其中Y基因编码CBP,Cameo2受C基因控制。　　 CBP序列中含一个START结构域,CBP蛋白能与叶黄素以1:1的摩尔比结合。在哺乳动物中,START结构域与胆固醇,磷脂酰胆碱,神经酰胺,叶黄素等多种脂类物质的结合及代谢相关。传统遗传分析认为Y基因主要是控制家蚕的中肠类胡萝卜素的吸收,而新的研究表明Y基因产物CBP,在黄茧N4品种的中肠和丝腺均有蛋白表达,即其可能在中肠和丝腺均与类胡萝卜素的吸收转运有关。此外,Y基因在黄红茧系多种茧色的形成中起关键作用,可能涉及不同类胡萝卜素的转运调控,因此,CBP也可能与多种类胡萝卜素转运相关。　　 Cameo2为CD36基因家族基因,与哺乳动物SR-BⅠ和果蝇ninaD同源。SR-BⅠ在哺乳动物中作为高密度脂蛋白受体,参与胆固醇,叶黄素,玉米黄素,β-胡萝卜素,维生素E等多种脂类的吸收转运。ninaD在果蝇细胞中参与细胞对叶黄素,玉米黄素,β-胡萝卜素的吸收。Cameo2在中肠和丝腺均有mRNA转录表达。　　 Y基因产物CBP和C基因产物Cameo2在家蚕类胡萝卜素选择性转运的两个关键部位,中肠和丝腺均有蛋白表达或mRNA转录表达,他们的同源基因或保守结构域在其他物种中都与脂类的转运密切相关,Y基因又在黄红茧系多种茧色形成过程中扮演关键作用,那么在黄茧家蚕主要茧色色素(叶黄素和β-胡萝卜素)转运过程中,CBP和Cmaoe2是否单独能够行使吸收转运功能?两者在类胡萝卜素的转运过程中是否存在协同作用?如果存在协同作用关系,两者是否具有蛋白质问的相互作用?Cmaoe2基因组上的同源串联基因Cameo1是否也与类胡萝卜素转运有关?本文针对以上问题,进行研究,得到了以下研究结果。　　 1.Cameo1,Cameo2与CBPmRNA转录表达与家蚕叶黄素转运相关性　　 取不同茧色品种家蚕茧色形成关键时期的组织,末龄3-6天的中肠和丝腺,提取RNA,反转录成cDNA,RT-PCR检测Cameol,Cameo2与CBP的mRNA转录表达与叶黄素转运相关性。　　 结果显示,以叶黄素为主要茧色形成色素的家蚕品种(03-210、柬埔寨和02.320)中,Cameol,Cameo2与CBPmRNA在中肠和丝腺中同时转录,在其他不是以叶黄素为主要茧色形成色素的家蚕品种(03-520、大造和秋白)中,Cameol,Cameo2与CBP不是同时在中肠和丝腺中转录,暗示Cameol,Cameo2与CBP这3个基因可能同时参与家蚕黄红茧形成过程中叶黄素在中肠和丝腺的转运。　　 2.家蚕类胡萝卜素转运相关蛋白在细胞水平对类胡萝卜素吸收转运的影响　　 将Cameo1,Cameo2,CBP,cbp(CBP缺失型)分别构建真核表达载体,转染HEK293细胞,对其进行细胞定位。结果显示,Cameo1和Cameo2定位在细胞质膜区域,CBP和cbp则分布在整个细胞。在单独转染和组合共转染细胞分别与含有叶黄素和β-胡萝卜素微粒的培养液孵育后,收集并破碎细胞,提取类胡萝卜素,HPLC检测细胞内类胡萝卜素含量。检测结果用SPSS17.0统计软件进行数据分析,结果显示,共表达Cameo2+CBP细胞叶黄素积累量是表达EGFP对照组的2.71倍,差异极显著(P=0＜0.01),且细胞叶黄素积累量具饱和性和浓度依赖性特点,这表明共表达Cameo2+CBP细胞对叶黄素的转运为细胞载体介导。表达以上蛋白的细胞,与表达EGFP对照组相比,细胞内β-胡萝卜素含量并无显著差异(P＞0.05),表明以上几种蛋白对β-胡萝卜素没有相应的转运功能。　　 3.家蚕类胡萝卜素转运相关蛋白相互作用的初步检测　　 运用BiFC(双分子荧光互补技术),将Cameo1和Cameo2分别构建到载体pBiFC-VC155(HA-CMVbackbone)上,CBP和cbp分别构建到载体pBiFC-VN173(FLAG-CMVbackbone)上,然后将Cameo1与CBP,Cameo2与CBP,Cameo1与cbp,Cameo1与cbp组合,共转染HEK293细胞。荧光显微镜观察显示CBP与Cameo1,CBP与Cameo2在细胞质膜区域可能有蛋白相互作用或者空间上的相互靠近。　　 综合RT-PCR实验,瞬时转染HEK293细胞色素孵育实验和BiFC实验结果,得出以下结论:Cameo2与CBP在可能同时在家蚕中肠和丝腺参与叶黄素的转运;Cameo2与CBP在细胞质膜区域可能具有蛋白间相互作用或者空间上的相互靠近;两者可协同作用将叶黄素跨膜转运,由细胞外转运到细胞内。　　 我们推测在色素转运过程中,Cameo2可能在细胞膜上起“捕获”叶黄素的作用,叶黄素随后被转移到细胞内,传递给细胞内的叶黄素结合蛋白CBP,使其在细胞内直接行使生理功能、积累或者进一步转运;Cameo2和CBP在细胞质膜区域的相互作用或者空间上的相互靠近可能起到传递脂类(叶黄素)的作用;在家蚕黄茧形成过程中叶黄素的转运可能需要Cameo2和CBP在中肠和丝腺同时存在,协同作用来完成。