微孢子虫(Microsporidia)隶属于真菌界（Fungi）、微孢子虫门(Microspora)、微孢子虫纲(Microsporea)、微孢子虫目(Microsporida)，是一类细胞内专性寄生的真核生物。微孢子虫在自然界具有广泛的宿主域，无论是低等的原生动物还是高等的人类都能被感染，如鱼类、兔类、啮齿动物、灵长动物，给人类造成不同程度的经济损失。家蚕微孢子虫普遍寄生于经济昆虫家蚕，引起家蚕微粒子病，是Nosema属的典型种。家蚕微粒子病对养蚕业是一种毁灭性病害，我国每年因微粒子病和带毒种造成的直接经济损失高达上千万元。因此，如何攻克家蚕微粒子病成为了蚕业界研究的重点和难点。　　 Serpin是一类不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂，在生理和病理条件下调节蛋白水解酶的活性。第一个被广泛研究的serpin家族成员是人类血浆蛋白质:抗凝血酶和抗胰蛋白酶，它们分别在血液凝集和炎症反应方面起关键作用。在家蚕微孢子虫基因组数据中，存在19个serpin基因，而在已公布的其他微孢子虫的基因组中，只有蜜蜂微孢子虫的基因组中存在5个serpin基因，从而暗示serpin对家蚕微孢子虫具有重要作用。本研究对家蚕微孢子虫的serpin进行了生物信息学分析，从而选取了NbSPN6进一步研究。本文对NbSPN6进行了酵母定位，接着进行克隆表达，获得NbSPN6蛋白并制备抗体，运用间接免疫荧光分析在微孢子虫中的定位特征;同时运用生物信息学、几丁质结合实验等对家蚕微孢子虫NbSPN6的功能进行了探索研究。主要研究结果如下:　　 1.家蚕微孢子虫NbSPN6序列特征及转录分析　　 家蚕微孢子虫基因组中存在19个serpin基因，对这些基因进行进化分析发现，NbSPN1单独聚为一枝，NbSPN6和NbSPN10聚为一枝;选取具有信号肽的10个serpin基因，发现NbSPN18、NbSPN13、NbSPN4和NbSPN19信号肽相似性很高，NbSPN2和NbSPN3信号肽只有一个氨基酸的差异，而NbSPN6和NbSPN10的信号肽完全相同。因此本研究选取了NbSPN6作为研究对象。生物信息学预测知NbSPN6其蛋白质分子量为47kDa，等电点为6.06;具有1个serpindomain;具有信号肽、非锚定蛋白、无跨膜螺旋结构，预测NbSPN6是一种分泌性蛋白。RCL铰链区的保守性推测NbSPN6为抑制性serpin。RT-PCR结果显示，NbSPN6在家蚕微孢子虫中具有转录活性，且在感染的初期就有表达，暗示NbSPN6在家蚕微孢子虫侵染家蚕的初期就开始发挥作用。利用酿酒酵母进行定位发现，具有信号肽的NbSPN6能够靶向酵母的线粒体。　　 2.家蚕微孢子虫NbSPN6的原核表达及抗体制备　　 设计NbSPN6的引物，提取家蚕微孢子虫的RNA，反转录成RNA，并进行NbSPN6基因的PCR扩增和克隆，构建pGEX-4T-1-NbSPN6的表达载体，进行pGEX-4T-1-NbSPN6重组蛋白的原核表达。利用切胶回收的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。Westernblotting检测家蚕微孢子虫总蛋白，结果显示成熟家蚕微孢子中存在NbSPN6蛋白，但NbSPN6蛋白条带比其理论分子量偏大，推测该蛋白在家蚕微孢子虫中可能存在糖基化等翻译后修饰。β-消除反应能够释放丝氨酸或苏氨酸连接的糖链，因此用0.4mol/L的NaOH处理家蚕微孢子总蛋白，杂交结果显示出比原来小的条带，其最小条带与预测结果相一致，说明NbSPN6蛋白存在一定程度的糖基化修饰。　　 3.家蚕微孢子虫NbSPN6的定位及功能初探　　 采用间接免疫荧光的方法对NbSPN6进行了定位分析，结果显示在家蚕微孢子虫中存在着NbSPN6蛋白，并分布在孢子外周。几丁质是构成家蚕微孢子虫孢壁的主要成分，通过与典型的几丁质基序比对发现，NbSPN6含有几丁质结合基序，利用重组NbSPN6蛋白与家蚕微孢子虫的几丁质壳进行结合实验，结果显示NbSPN6蛋白具有与几丁质结合的能力，与定位到孢子外周相一致。推测NbSPN6蛋白可能参与调控宿主的免疫进程，或抑制宿主蛋白酶。　　 为了验证NbSPN6的分泌性，检测感染微孢子虫的宿主细胞胞质内是否含有NbSPN6蛋白，利用anti-NbSPN6作为一抗，进行IFA实验。结果显示感染微孢子虫的BmE细胞的胞质内具有弥散的荧光信号。利用感染细胞的上清和沉淀进行的Westernblotting显示在上清中也能杂交出单一条带，证实了NbSPN6是一种分泌性蛋白，可能与宿主细胞的蛋白进行相互作用，推测其可能参与调控宿主的免疫反应，从而有利于微孢子虫侵染宿主时，在宿主体内生存和繁殖。