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目的:建立用膜滤过分离肿瘤细胞技术(Isolation by size of epithelial tumor cells,ISET)联合激光扫描细胞计量仪(Laser Scanning Cytometry LSC)检测循环肿瘤细胞(circulating tumor cells CTC)的方法,运用该方法检测肿瘤患者的CTC,并探讨CTC数量与患者的临床分期、原发肿瘤大小、淋巴结转移等的关系。方法:(1)用ISET技术(孔径8um的聚碳酸酯滤膜滤过标本)初步分选出肿瘤细胞后,用细胞角蛋白8(Cytokeratins8,CK8)抗体和白细胞共同抗原CD45(leukocyte common antigen,LCA)抗体染色并用核酸染料DAPI(4,6- diamidino- 2-phenylindole 4’,6二脒基苯基吲哚)进行细胞核染色后用LSC进行扫描分析,选出CK8+且CD45-的细胞为阳性细胞,后根据DAPI染色后细胞核形态、大小等最终确认肿瘤细胞。(2)将不同数量的乳腺癌细胞系(MCF-7)细胞混入健康血标本中,用建立的方法检测以验证该方法细胞回收率及检测敏感性和特异性。(3)用该方法检测50例有远处转移的晚期肿瘤(Ⅳ期)患者(其中乳腺癌患者25例)、22例可手术的肿瘤(Ⅰ-Ⅲ期)患者(其中乳腺癌患者20例)的CTC和30例健康者作为正常对照,分析CTC数量与肿瘤患者临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移等临床因素之间的关系。结果:(1)8um孔径的聚碳酸酯滤膜能滤过99%的正常外周血白细胞而留住97%的肿瘤细胞,CK8抗体对肿瘤细胞、CD45抗体对粒细胞染色特异性均达到99%以上,通过LSC扫描分析所得阳性细胞(CK8+且CD45-)可经形态学观察最终确认为肿瘤细胞。(2)通过多次对混入不同数量肿瘤细胞的模拟标本检测的结果显示该方法的肿瘤细胞回收率为10.34±1.15%,在混入60-600000个肿瘤细胞范围内回收率保持稳定(P>0.05);该方法敏感性高,特异性强,可检测到1ml血中一个肿瘤细胞而相同条件下空白对照组均未检出肿瘤细胞。(3)临床标本检测显示,50例Ⅳ期肿瘤患者有39例(78%)检出CTC,22例Ⅰ-Ⅲ期肿瘤患者有11例(50%)检出CTC,3O例健康者均未检测到CTC(0%)。肿瘤患者CTC检出率均明显高于健康对照组(P<0.05),Ⅳ期肿瘤患者CTC检出率高于Ⅰ-Ⅲ期肿瘤患者(P<0.05)。(4)45例乳腺癌患者随着临床分期的增高,CTC数量逐渐增高;Ⅳ期患者的CTC数量(8.60±1.39)明显高于Ⅰ-Ⅲ期患者(3.45±1.08)(P<0.05);Ⅲ期-Ⅳ期患者CTC数量(8.44±1.33)也显著高于Ⅰ-Ⅱ期患者CTC数量(3.11±1.05)(P<0.05);此外,有淋巴结转移情况患者的CTC数量(7.63±1.26)显著高于无淋巴结转移患者(2.80±1.46)(P<0.05),而肿瘤大小不同、以及激素受体和Her-2表达水平不同的患者之间CTC数量未见显著性差别(P均>0.05)。结论:(1)用膜滤过联合激光扫描细胞计量仪检测恶性肿瘤患者CTC方法简便,敏感性高、特异性强。(2)用该方法不仅在晚期(Ⅳ期)肿瘤患者中检出CTC,也可在早期(Ⅰ-Ⅲ期)术后患者检出CTC,提示可用该方法检测肿瘤患者CTC来评估晚期患者治疗(如化疗)或早期患者术后辅助治疗的疗效。(3)CTC数量与乳腺癌患者的临床分期早晚和淋巴结转移相关,提示CTC数量可作为乳腺癌患者预后判断的一个指标。