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目的：探讨猪骨髓间充质干细胞体外自发分化及不同诱导方式分化为心肌细胞的潜能及分分泌VEGF的规律。方法：抽取猪骨髓,密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁培养法筛选和培养MSCs,研究自然培养条件下第1、2、3、4、5代细胞向心肌细胞分化潜能和分泌VEGF的规律；选取P1MSCs,分别用5-氮胞苷、心肌组织裂解液、5-氮胞苷+心肌组织裂解液诱导1周、2周、3周,研究其分化、分泌的规律。各代细胞采用连续显微镜下观察、免疫细胞化学染色法、Real Time-PCR、ELISA.透射电镜检测相关指标。结果：体外自然培养条件下,P1-P5MSCs形态基本一致,呈梭形成纤维细胞样外观。经心肌组织裂解液处理1周后,MSCs增殖活跃,细胞形态均一,呈旋涡状排列。各诱导组诱导3周后,细胞胞质内颗粒增粗,培养基中碎片增多,D组MSCs有部分不再贴壁。提取后传代的P1细胞,100%表达CD29、CD90,而0%的细胞表达CD45,说明贴壁培养的细胞为MSCs。免疫细胞化学染色显示,自然培养状态下,P4MSCs表达Connexin43、cTnT、 α-sarcomeric actin,与其它代MSCs相比有显著性差别(P<0.001)。诱导2周后,5-氮胞苷与心肌组织裂解液共同诱导组表达Connexin43、cTnT、a-sarcomeric actin,与其它组MSCs相比有显著性差别(P<0.001)。Real Time-PCR结果显示,P1-P5MSCs在体外自然培养状态下都可表达connexin43、VEGF及心肌特异性蛋白基因cTnI, P4细胞表达量最高(P<0.001)而P0细胞不表达cTnI,仅表达少量connexin43。A、B、C、D各组细胞诱导1周、2周、3周都可表达Connexin43, cTnI和VEGF。诱导1周、2周后,C组表达量高于其它各组(P<0.001)。各组细胞Connexin43, cTnl和VEGF的表达量在诱导2周时最高,3周时最低。ELISA检测结果显示,各处理组细胞条件培养基浓缩20倍,VEGF含量均低于<37.5pg/ml。透射电镜显示自然培养状态下,部分P1-P5MSCs胞质内可见细肌丝束。P4MSCs胞质内可见多束细肌丝,密体结构清晰。A、B、C、D四组MSCs处理2周后,胞质内均可见细肌丝束,密体结构清晰可见。B、C两组可见质膜相贴,局部电子密度增高,出现非特异的细胞连接。C组细胞内偶见肌节样结构形成。结论：1.猪骨髓MSCs体外自然培养条件下,各代之间形态、分化潜能存在着差异,向心肌细胞分化能力随细胞年龄先增强,后减低。本实验中的拐点为P4。2.5-氮胞苷与心肌组织裂解液共同诱导相比单独使用5-氮胞苷或心肌组织裂解液诱导效率更高,诱导2周后分化效率最高,诱导3周基本丧失向心肌细胞分化能力。3.体外短期培养过程中(<3周)猪骨髓MSCs旁分泌VEGF可能与其向心肌样细胞分化程度一致。