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为探讨转录激活蛋白2α(activator protein-2α,AP-2α,TFAP2A)对牛双核滋养层巨细胞(binucleate trophoblast giant cells,BNC)特异表达基因的转录调控作用,本实验培养了牛原代滋养层巨细胞,对其进行了核染色和细胞免疫化学染色鉴定,以建立细胞模型进行体外实验。采用电转技术将化学合成AP-2αsiRNA导入原代细胞,用流式细胞仪和荧光显微镜检测干扰效率,采用台盼蓝染色检测细胞存活率,优化转染条件以找到最佳电转参数；采用荧光定量PCK检测AP-2αsiRNA对内源TFAP2A的干扰效率,筛选出最佳干扰位点；最后采用荧光定量PCR分别检测干扰后BNC特异表达基因Csh1、PRP-Ⅰ和PAG1的mRNA水平。
本研究主要分为两个部分:
一、牛滋养层巨细胞的培养和鉴定
取怀孕牛45-60天的完整子宫,无菌条件下收集胚胎子叶,Ⅰ型胶原酶消化分离细胞后采用Percoll细胞分离液纯化滋养层细胞。用含15％胎牛血清和滋养层细胞生长添加剂(trophoblast growth supplement,TGS)的DMEM培养基培养细胞,并用差异贴壁法再次进行纯化。采用台盼蓝和Hoechst33342细胞染色液对细胞活力及形态学进行分析。采用波形蛋白和角蛋白免疫细胞化学法进行鉴定。结果显示,本实验分离的细胞经台盼蓝染色后细胞存活率大于90％,用Percoll细胞分离法纯化后BNC的纯度可达30％,细胞培养10天后,BNC占细胞总数的45-50％。抗细胞角蛋白抗体检测呈阳性,抗波形蛋白抗体检测呈阴性,经核染可见典型双核特征。本实验建立了一种相对快速、简便、能够培养相对较高纯度的牛原代胚胎滋养层巨细胞的方法。
二、AP-2αsiRNA电转染原代BNC细胞
培养后第10天收获细胞,将化学合成的AP-2αsiRNA干扰链,采用电转仪转染入纯化后的BNC,首先转入带荧光标记基团的siRNA(NC-siRNA-FAM),4小时后用流式细胞仪和台盼蓝染色分别检测转染效率和细胞活率。再转入不同位点的干扰链,48小时后用实时荧光定量PCR检测AP-2αmRNA水平,以筛选出最佳干涉位点。以最佳干涉位点的siRNA进行实验,即转入该siRNA干扰链,48小时后RT-PCR测定Csh1、PRP-Ⅰ和PAG1的mRNA水平。本研究采用电转染方法,结果显示,最佳优化条件为:细胞密度调整为500μl PBS含2×106个细胞,加入6μgNC-siRNA-FAM,电转参数为2×120V,2ms。在此参数下阳性细胞率达到93.5±1.66％,且细胞存活率为78.56±5.93％。初步建立了有效的siRNA电转入牛滋养层巨细胞的方法。PCR结果显示,与对照组和ns-siRNA组相比,AP-2αsiRNA干扰效率可迭72.30±3.28％,差异极显著(P<0.01),转染后内源性Csh1和PRP-Ⅰ的mRNA水平分别下降了65.45±6.38％,40.73±11.72％,差异极显著(P<0.01)；而PAG1的mRNA水平减少了11.59±1.88％,与ns-siRNA组相比差异不显著(P>0.05),数据表明AP-2α可能直接作用于Csh1和PRP-Ⅰ基因的AP-2结合位点,或与AP-2其他家族成员或转录因子共同作用从而参与了Csh1和PRP-Ⅰ基因的转录调控,而AP-2α对PAG1的转录调控还有待研究。