论文部分内容阅读
中慢生型天山根瘤菌能够在甘草的根部共生结瘤固氮,提供植物生长所需的氮源。这种共生关系的建立依赖于根瘤菌与宿主植物之间复杂的信息交流。在甘草萌发初期,其分泌的抗菌物质刀豆氨酸能够杀死植株周围可能的有害细菌,而在天山根瘤菌中存在着刀豆氨酸的外运系统MsiAR系统,使其在甘草根际选择性的环境下继续繁殖,成为优势菌群,为后来的结瘤共生提供有力条件。 MsiR蛋白,属于LysR转录调控家族成员,能够启动msiA基因的表达,刀豆氨酸作为辅助诱导物。LysR型转录调控蛋白是原核生物转录调控蛋白中最大的一类家族蛋白,参与调控的基因类型多种多样,包括毒力、代谢、群体感应和游动性等多种功能基因。本文以MsiR为主要研究对象,探究MsiR对msiA基因表达的调控机制,丰富对LysR家族的转录调控机制的认识,实现工业应用的价值。 为研究MsiR对msiA的调控机制,将MsiR在大肠杆菌中进行重组表达及纯化。通过EMSA实验证实MsiR蛋白与启动子DNA的结合,加入刀豆氨酸能增强这种结合。与此同时,通过等温量热滴定确定了刀豆氨酸与MsiR之间存在相互作用,刀豆氨酸与MsiR结合的化学计量数为1,Kd值为1.86μM。 通过5race实验确定了msiA基因的转录起始位点,并由此推测了-10区和-35区。采用启动子长度步移及定点突变确定了影响MsiR转录调控活性的5个重要位点:RBS-1(-70,-67)、RBS-2(-59,-56)、 ABS-1(-50,-47)、 ABS-2(-41,-37)、ABS-3(-30,-27),并由此预测了MsiR蛋白的转录调控模型: 无刀豆氨酸存在的情况下,MsiR以四聚体形式存在,并呈现出开放型的构象,其结合到msiA调控区的RBS-1、RBS-2、ABS-2、ABS-3位点。此时,DNA的弯曲角度较缓,MsiR遮住了msiA启动子的-35区,使RNA聚合酶与启动子DNA结合效率大大降低,基因的表达水平处于极低的状态。 在加入了刀豆氨酸以后MsiR仍以四聚体形式存在,但转变成为紧缩型的构象结合到msiA调控区的RBS-1、RBS-2、ABS-2位点,此时,DNA的弯曲角度变大,被遮盖的msiA启动子的-35区暴露出来,RNA聚合酶与启动子DNA的结合效率有了明显的提高,基因的表达水平处于较高的状态。 最后,本研究构建了MsiR突变文库,进行了丧失转录调节活性突变株和37℃诱导高可溶性突变株的筛选,得到了影响MsiR生理特性的重要位点,具有十分重要的理论价值。