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根据本实验室发现的鸭瘟病毒(DPV)TK基因(GenBank登录号DQ640611)设计并合成了特异性引物,对DPV TK基因进行PCR扩增、序列测定及生物信息学分析,并开展了TK基因原核表达及其免疫原性检测,间接免疫过氧化物酶组织化学染色法(IISM)和间接免疫荧光法(IFA)检测DPV TK基因表达产物方法的建立及其在人工感染鸭体内表达定位的系列研究,获如下结果:1.DPV TK基因分子特性该基因含1077bp,编码358aa。TK蛋白含有两个功能结构域:ATP结合结构域(-DGX XGXG K-)和核苷酸结合结构域(-DRH-)。系统进化树表明DPV TK基因与MDV、ILTV、HVT等禽类疱疹病毒的进化关系最近,与其他疱疹病毒关系则较远。2.DPV TK基因原核表达及其多克隆抗体制备对扩增的TK基因进行pMD18-T载体克隆,通过对pMD18-T-TK及pET-32a(+)进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切、连接,将TK基因定向插入pET-32a(+),经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定表明,成功构建重组表达质粒pET-32a-TK,并转化入表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物以融合表达的包涵体形式存在,大小为58Ku左右。对表达条件进行优化,确定最佳表达条件为IPTG0.6mmol/L,诱导4h。利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析方法对其进行纯化,获得较高纯度的重组蛋白。过柱纯化蛋白对家兔进行免疫,制备兔高免血清,Western-Blotting检测显示,与重组表达蛋白特异性结合;ELISA效价高达1:512000。3.间接免疫组化和间接免疫荧光法检测DPV TK基因表达产物方法的建立及其在人工感染鸭体内表达定位对制备兔抗DPV TK高免血清,采用High-Q阴离子柱层析纯化得到兔抗DPVTK IgG,建立间接免疫过氧化物酶组织化学染色法(IISM)和间接免疫荧光法(IFA)检测石蜡切片中DPV的方法;利用建立的IISM和IFA对28日龄鸭人工感染DPV死亡鸭不同组织器官以进行检测。IISM和IFA检测28日龄人工感染DPV死亡鸭的不同组织器官石蜡切片,脑、心、肝、脾、肺、肾、胰脏、腺胃、法氏囊、食道、胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、哈德氏腺为阳性或强阳性。该法具有直观、特异性强的优点,应用于检测DPV TK在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位具有良好效果,也可用于DPV感染的实验室诊断、病原在鸭组织细胞中分布研究。