论文部分内容阅读
细胞中蛋白质的正确折叠对其发挥正常的生物学功能、维持细胞内环境的稳态具有重要作用。真核细胞分子伴侣素TRiC/CCT属于Ⅱ型分子伴侣素，存在于所有真核细胞的细胞质中，具有双环背对背堆叠结构。TRiC可以协助10％的胞质蛋白进行折叠，包括细胞骨架中的肌动蛋白和微管蛋白，控制细胞周期进程的cyclin E蛋白，调控细胞信号转导的PhLP蛋白等参与重要细胞活动的关键组成成分。而且TRiC可以协助许多肿瘤相关蛋白质的折叠，如p53，VHL肿瘤抑制蛋白和STAT3等。TRiC功能的缺失与癌症和神经退行性疾病（如亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默症和帕金森症等）密切相关。 TRiC拥有8个不同的亚基，分子量达到1MDa，是最为复杂的分子伴侣素，其功能的实施与其在ATP驱动下的构象变化密切相关。然而由于该超大分子复合体具有动态性、多构象性以及溶液中取向分布倾向性(preferred orientation)等特征，至今仍缺乏TRiC的高分辨率结构信息;其亚基排布仍存在争议，其在ATP驱动下的构象变化细节仍然未知，限制了人们对TRiC协助底物折叠机制的认知。 在本研究中，我们解析了酵母源TRiC在首次发现的核苷酸部分预加载(nucleotide partially preloaded，NPP)状态及AMP-PNP模拟的ATP结合状态下的高分辨冷冻电镜三维结构（分别达到4.7(A)及4.6(A)分辨率），其中ATP结合状态结构是目前TRiC在开环状态下分辨率最高的三维结构。同时，通过发展的亚基中位eGFP标签定位方法，实现了对开环状态下TRiC亚基的精确定位。我们的结构第一次揭示了CCT2亚基对(subunit pair)独特的Z字形特征，并发现ATP结合可以驱动CCT2一侧的亚基发生剧烈构象变化，揭示了CCT2亚基在整个复合体协同变构过程中的关键作用。首次发现TRiC位于CCT6一侧的三个亚基可以锁住酵母本底环境中的核苷酸（主要以ADP形式存在）并且不易被取代，揭示了TRiC在结合ATP过程中按特定的时空顺序、分阶段进行的结构机制。研究阐释了TRiC复合体在进化过程中在结构和功能上已分化为两个部分，以及TRiC如何协调其构象变化产生的机械力进而实现协助底物折叠为最终产物的结构基础，加深了人们对TRiC高度协同性及其特异性识别并折叠底物机制的认识。 本研究应用冷冻电镜技术结合生化分析等方法揭示了真核生物分子伴侣素TRiC/CCT在结合ATP过程中按特定的时空顺序、分阶段进行的结构机制，实现了对TRiC开环状态的亚基精确定位，为深入阐释TRiC高度协同性及其特异性识别并折叠底物的机制提供了结构基础。