第一章核受体与核孤儿受体TR3概述　　 核受体是一类进化上相关的、具有共同结构特征、能够与DNA特异结合的转录因子。它们能以单体、同源二聚体或者异源二聚体的形式结合到相应的激素应答元件上，对靶基因的转录进行调控，在生物体的生长发育、细胞分化、存活和凋亡以及维持内稳态平衡等多种生理活动中发挥重要作用。由于其功能重要而复杂，很多核受体与诸如癌症、糖尿病、老年痴呆、心血管疾病、不育症和激素抵抗综合征等多种疾病有着密切关系，因此核受体也成为了药物研发的重要标靶。经典核受体转录激活功能受配体的调节，因此寻找和研究核受体的配体，对靶向核受体的药物的研发具有重要意义。　　 TR3（也称Nur77、NGFI-B、N10和NAK1）是由立早基因(immediate-early genes) NR4A1编码的孤儿受体，是核受体超家族的重要成员之一。它在结构上具有核受体的典型特征，但其内源性配体至今尚未被发现，因此也被称为核孤儿受体（orphan nuclear receptor）。TR3能够以细胞特异的方式在各种不同外界信号(如血清、生长因子、炎症因子、内分泌素、抗原受体连接(antigen receptor ligation)以及凋亡刺激）的诱导下迅速表达，并在调控细胞生长、分化、凋亡、能量代谢、炎症反应血管再生等过程中发挥重要的作用。作为转录因子，TR3以单体、同源二聚体和异源二聚体与不同的应答元件NBRE、NurRE或DR5结合，调控许多基因的转录，从而参与调控许多生命过程;TR3还能够出核转定位于线粒体，诱导细胞凋亡。此外，TR3还能够作为调控蛋白，通过蛋白质之间的相互作用来影响其他蛋白的生物学功能。　　 本章节对核受体超家族和孤儿受体TR3的结构、作用机制和生物学功能及药物开发或配体研究情况进行了综述。　　 第二章生物大分子X射线晶体学　　 结构生物学通过研究生物大分子（尤其是蛋白和核酸分子）、大分子复合物或组装体的结构及其结构与功能的关系，来揭示生命现象的物理和化学本质。目前已经发展成熟的研究生物大分子结构的方法有多种，其中X射线晶体学、核磁共振技术(NMR)和冷冻电镜(cryo-(EM)三维重构是当今结构生物学的主要研究手段。这三种方法各有独到之处，又有局限和不足。作为最早发展起来的结构生物学研究手段，X射线晶体学以其分辨率高，原子坐标精确，不受蛋白大小限制等优点成为目前解析蛋白质结构的主要手段。目前PDB(Protein Data Bank)中收录的蛋白结构中有大约85％是利用X射线晶体学的方法获得的。　　 本章对本论文重点使用的技术手段——X射线晶体学进行以下几方面的介绍:蛋白晶体的培养、衍射数据的收集处理、X射线晶体学的基本原理、相位获取的方法原理、模型构建及修正等。对于本论文采用的分子置换法解相角的原理和相关软件我们做重点介绍。　　 第三章小分子拮抗剂TMPA靶向TR3 LBD的结构研究　　 TR3 LBD缺乏典型的配体结合口袋(LBP)及共激活因子结合位点。最近发现小分子化合物Cytosporone B(Csn-B)能够结合TR3的LBD激活TR3下游基因的转录。如今，吴乔实验室又发现Csn-B的一种衍生物TMPA(ethyl2-[2，3，4trimethoxy-6(1-octanoyl) phenyl] acetate)可以通过结合TR3 LBD来阻断TR3与LKB1的相互作用，从而激活AMPK信号通路，影响糖代谢。为了证明TMPA能够直接结合TR3 LBD影响LKB1-AMPK信号转导，我们与吴乔实验室合作，对TMPA与TR3 LBD的复合物结构展开了研究。通过本章研究，我们获得了2.06(A)的TR3 LBD晶体结构和2.22(A)的TMPA-TR3 LBD复合物晶体结构。通过结构对比发现TMPA的结合并不改变TR3 LBD的构象;TMPA在TR3 LBD上有两个结合位点Site A和Site B，这两个位点都不是深埋于LBD内部的典型配体结合口袋，而是LBD分子表面的两个浅缝;对基于结构设计的突变体进行荧光实验发现Site A的C566对于TMPA的结合至关重要，而T595对于LKB1的相互作用很重要。说明Site A在LKB1结合位点附近，TMPA结合到SiteA上能够阻断LBD1的结合。　　 通过本章的研究，不仅从结构角度证明了TMPA能够结合TR3 LBD，并且阐明了TMPA与TR3 LBD的作用位点及其影响LKB1结合TR3 LBD的作用机制。更为今后以TMPA为药物前体，进行基于结构的药物设计，开发靶向TR3 LBD治疗糖尿病的药物奠定了基础。　　 第四章核孤儿受体TR3 LBD结构域的二聚化研究　　 TR3家族受体能够以单体、同源二聚体、家族内异源二聚体的形式调控下游基因的转录激活，TR3还能够与RXR异源二聚化结合相应应答元件。核受体的经典二聚化位点为H9-H10区域，体内研究显示Nurr1（TR3家族的另一个成员）与RXR的二聚化与I-box（位于H10C端）有关但不能排除还有其他I-box以外的二聚化位点。本章首先对TR3家族LBD的晶体结构进行了研究，发现TR3家族LBD晶体中都不存在H9-H10区域的分子间相互作用，这与其他大部分核受体不同。我们的晶体结构中TR3 LBD以H11-H12疏水面发生二聚化，软件分析该二聚化界面面积为592(A)2，具有特异性，并且TR3家族成员的LBD晶体结构中都存在此相互作用面。X射线小角散射实验、凝胶过滤层析及分析性超速离心证明TR3 LBD在溶液状态下主要以单体形式存在，少量为二聚体及多聚体。低pH值有利于LBD二聚体的稳定，这与我们在低pH值条件下才能获得衍射能力强的TR3 LBD晶体的情况吻合。对H11-H12疏水面进行分析，突变其中一些关键疏水氨基酸后，发现F574、F592和F598等位点对LBD的二聚化具有重要作用，但是H12上还有其他氨基酸影响TR3 LBD的二聚化。　　 通过本章研究发现TR3的LBD结构域通过非经典的H11-H12疏水面发生二聚化。这种二聚化对TR3的活性调节具有重要意义，是对TR3转录激活机制的重要补充。